Подагра и лейкоциты

Взаимодействие с эндотелием необходимо для того, чтобы лейкоциты переходили из крови во внесосудистые ткани, и такие взаимодействия облегчаются при воспалении благодаря скоординированной экспрессии молекул эндотелиальной адгезии и хемоаттрактантов. В литературе мало информации о том, как активация эндотелия изменяется в ходе воспалительных реакций и как такое изменение влияет на количество рекрутирующих лейкоцитов и типы рекрутированных лейкоцитов.

   Подагра, по-видимому, кажется  простым заболеванием с этиологической точки зрения, вызванным внутрисуставным осаждением кристаллов моногидрата урат натрия (MSU) у лиц с повышенными концентрациями мочевой кислоты в сыворотке крови. После описания клинических особенностей подагры Гиппократом в четвертом веке до нашей эры, вехами в понимании этиологии подагры были обнаружение кристаллов в синовиальной жидкости Антоном ван Левенгуком в семнадцатом веке, определение основного ингредиента подагры. -связанные камни и мочевая кислота у Шееле и Волластона, соответственно, в восемнадцатом веке, и связь подагры с гиперурикемией у Гаррода в девятнадцатом веке. Однако в двадцатом веке исследование Framlingham показало, что гиперурикемия не обязательно приводит к клинической подагре. Таким образом, кумулятивная заболеваемость острым подагрическим артритом в течение 12-летнего периода у мужчин с гиперурикемией (концентрация мочевой кислоты в сыворотке выше 8 мг / дл (0,48 ммоль / л) составила всего 36%.  Эта относительно слабая связь между гиперурикемией и подагрой может быть объяснена, по крайней мере частично, различиями между индивидами в способности образовывать и выращивать кристаллы MSU. Тем не менее, мы знаем, что другие факторы, помимо присутствия кристаллов, участвуют в возникновении острого приступа подагры, поскольку присутствие кристаллов можно легко обнаружить в образцах синовиальной жидкости, взятых из "бессимптомных суставов".  Возможный ключ к роли лейкоцитов в определении воспалительного баланса при гиперурикемии предполагался на основе наблюдения, что клеточный инфильтрат при острой подагре является преимущественно нейтрофильным, тогда как при бессимптомной подагре лейкоцитарный инфильтрат почти исключительно мононуклеарный. 

   Адгезия лейкоцитов к эндотелию сосудов является необходимым условием их эмиграции в ткани при воспалении. Общие механизмы, которые позволяют лейкоцитам прилипать к эндотелиальным клеткам сосудов и мигрировать в ткани, в настоящее время достаточно хорошо изучены: они включают последовательный захват из свободного потока через селектины, активацию рецепторов, связанных с G-белком, и последующую опосредованную интегрином остановку на поверхностях клеток эндотелия.  Основным для этих взаимодействий звеном является активация эндотелиальных клеток, которая приводит к повышенной экспрессии селектинов, хемокинов и лигандов интегрина на поверхности эндотелиальных клеток. 

   Активация эндотелиальных клеток происходит в ответ на изменения в микроокружении ткани и может быть классифицирована в соответствии с требованием синтеза белка de novo . Стимуляция эндотелиальных клеток агонистами, такими как гистамин, C5a или тромбин, приводит к быстрой транслокации тел Вейбеля-Палада на поверхность просвета с включением предварительно синтезированного P-селектина в плазматическую мембрану и высвобождением IL-8 и фактора Виллебранда.  Этот процесс, который аналогичен дегрануляции тучных клеток, обеспечивает быстрый, но временный механизм для инициирования взаимодействия лейкоцитов с эндотелиальными клетками в течение нескольких секунд после активации ткани.   Напротив, более задержанный и устойчивый ответ происходит за счет стимуляции программы транскрипции генов и синтеза белка de novo адгезивных молекул и хемокинов, которые включают E-селектин, молекулу межклеточной адгезии-1 (ICAM-1), молекулу адгезии сосудистых клеток -1 (VCAM-1), IL-8 и MCP-1. Агонисты, которые лучше всего характеризуются как индуцирующие этот транскрипционный ответ, представляют собой цитокины IL-1α / β и фактор некроза опухоли (TNF) -α . Недавно были получены данные, свидетельствующие о том, что IL-1 может увеличивать содержание IL-8 в теле Вейбеля-Палада, обеспечивая средства, с помощью которых эндотелиальные клетки могут вызывать усиленный немедленный ответ при последующем повторном заражении .

   Инъекция IL-1 или TNF-α в кожу in vivo стимулирует подострый воспалительный ответ, связанный с выраженной эмиграцией лейкоцитов, который можно определить количественно путем измерения поглощения внутривенно введенных радиоактивно меченных лейкоцитов. Чтобы связать поглощение лейкоцитов с активацией эндотелия, Hascard D., Landis R. ( 2002)  разработали для свиньи методику количественного определения экспрессии молекул адгезии путем измерения поглощения антител с радиоактивной меткой с использованием неспецифического антитела с радиоактивной меткой в ​​качестве внутреннего контроля. Это позволило авторам исслдеования  продемонстрировать тесную связь между началом рекрутирования нейтрофилов и экспрессией E-селектина как в ответ на инъекцию цитокинов, таких как IL-1 или TNF-α, так и во время реакций отсроченной гиперчувствительности. С тех пор аналогичный подход был принят для измерения активации эндотелия и экспрессии молекул адгезии на моделях воспаления у крыс и мышей. 

   Разработки в понимании общих механизмов оборота лейкоцитов в настоящее время позволяют начать детальное изучение связи между активацией эндотелия и оборотом лейкоцитов при воспалительных ревматических заболеваниях. Поскольку этиология известна, острая подагра представляет собой относительно доступное, самоограничивающееся воспалительное состояние, при котором можно моделировать механизмы, которые могут лежать в основе других ремиттирующих заболеваний. В частности, авторы рассмотрели вопросы о том, как лейкоциты рекрутируются в ткани во время фазы усиления острой атаки, а затем о том, как эта атака спонтанно разрешается.

  Инъекция кристаллов MSU в кожу человека приводит к эритематозной реакции, которая максимальна через 24 часа, а затем самопроизвольно спадает. Реакция очень похожа на подобные реакции на коже свиньи, предоставляя хорошую модель для изучения того, как активация эндотелия и рекрутирование лейкоцитов связаны с течением времени воспаления, вызванного кристаллами MSU. Авторы проанализировали активацию эндотелия и доставку лейкоцитов путем измерения поглощения дифференциально радиоактивно меченных анти-Е-селектина, нейтрофилов и / или мононуклеарных клеток в различные моменты времени после внутрикожного введения кристаллов MSU .

     Активация лейкоцитов  началась от 1 до 2 часов после инъекции кристаллов MSU,  параллельно с началом экспрессии Е-селектина.  Неожиданно фаза экспрессии E-селектина и рекрутирования лейкоцитов была достаточно короткой, и оба процесса вернулись к исходному уровню к пику эритемы через 24 часа. Через 24 часа эритема рассосалась, несмотря на продолжающееся присутствие кристаллов MSU в коже. При рассмотрении связи между активацией эндотелия и переносом лейкоцитов и кинетикой воспалительного ответа можно сделать три вывода. Во-первых, начальная активация эндотелия и рекрутирование лейкоцитов были тесно связаны. Во-вторых, временная природа экспрессии эндотелиального E-селектина и рекрутирования лейкоцитов, по-видимому, ограничивают проникновение лейкоцитов в ткани до относительно ранней стадии ответа. Наконец, можно предположить , что эритема является отражением постмиграционной активации лейкоцитов .

    Кристаллы MSU способны активировать ряд острых воспалительных путей, которые могут вызывать и / или усиливать острый приступ подагры. К ним относятся альтернативный путь комплемента и системы калликреина, а также стимуляция дегрануляции тучных клеток с быстрым высвобождением вазоактивных медиаторов и TNF-α . Исследователи  уделили особое внимание моноциту, так как он обладает потенциалом для замедленного высвобождения эндотелиальных активирующих факторов. Известно, что моноциты реагируют на фагоцитоз кристаллов MSU путем активации экспрессии ряда провоспалительных генов, в том числе кодирующих интерлейкин (IL) -1 , IL-6 , IL-8 , TNF- α  и COX-2 . В случае IL-8 транскрипция гена следует за передачей сигналов посредством фосфорилирования тирозина внеклеточно регулируемой киназы (ERK) 1 / ERK2, p38 MAPK (митоген-активируемая протеинкиназа) и JNK (c-Jun N-терминальная киназа.  Промоторный анализ показал, что транскрипционная активация гена IL-8 кристаллами MSU включает связывание белка-активатора 1 и комплекса NF-κB c-Rel / RelA с промотором IL-8 .

    Чтобы определить, какие моноцитарные факторы ответственны за активацию экспрессии молекулы адгезии эндотелиальных клеток, исследователи  создали модель in vitro, в которой супернатанты моноцитов, стимулированные кристаллами MSU, переносили в культуры эндотелиальных клеток в присутствии нейтрализующих антител. цитокинам-кандидатам . Эти эксперименты показали, что способность стимулированных MSU моноцитов индуцировать экспрессию молекул адгезии E-селектина, ICAM-1 и VCAM-1 полностью обусловлена ​​высвобождением TNF-α и IL-1β. Кроме того, когда время продуцирования этих двух цитокинов было изучено более детально, было обнаружено, что секреция IL-1β предшествует секреции TNF-α.

  Опосредованная цитокинами активация эндотелия in vivo может быть продемонстрирована с помощью визуализации поглощения внутривенно введенных моноклональных антител против E-селектина, как показано при ревматоидном артрите (RA)  и воспалительных заболеваниях кишечника . Используя модель свиного MSU-индуцированного кристаллами артрита , исследователи обнаружили, что экспрессия E-селектина и рекрутирование нейтрофилов ингибировались приблизительно на 50% в присутствии нейтрализующих антител к TNF-α, что согласуется с данными, найденными in vitro.

   Был предложен ряд механизмов для учета спонтанного разрешения острой подагры. К ним относятся покрытие кристаллов защитными белками и противовоспалительное действие гипоталамо-гипофизарной оси . Кроме того, воспаление будет снижаться при апоптозе нейтрофилов в тканях, хотя апоптоз нейтрофилов может задерживаться поглощением кристаллов MSU. Апоптотические нейтрофилы быстро и эффективно фагоцитируются тканевыми макрофагами и, возможно, также другими резидентными клетками. Считается, что это защищает ткани от повреждения, вызванного аутолизом и утечкой содержимого апоптотических нейтрофилов, и, несомненно, уменьшает продолжительность и степень воспаления, опосредованного нейтрофилами. Важно, что клиренс апоптотических нейтрофилов макрофагами происходит без выработки провоспалительных цитокинов. Вместо этого макрофаги, которые поглощают апоптотические нейтрофилы, могут генерировать факторы с противовоспалительными свойствами, включая трансформирующий фактор роста-β, фактор, активирующий тромбоциты, и простагландин E 2. Доказательства поглощения апоптотических нейтрофилов макрофагами при подагре существуют в форме клетки Рейтера, которую можно обнаружить в синовиальной жидкости во время острого приступа подагры. 

   С 1970-х годов известно, что кристаллы MSU можно найти в бессимптомных суставах людей с гиперурикемией. При исследовании лейкоцитов синовиальной жидкости, связанных с кристаллами, было обнаружено, что> 99,5% интернализованных кристаллов содержится в мононуклеарных клетках, но почти никогда не содержится в нейтрофилах . Это наблюдение показало, что, хотя моноциты вызывают провоспалительный ответ при поглощении кристаллов MSU, макрофаги могут очищать кристаллы без индукции провоспалительной активности, аналогично клиренсу апоптотических нейтрофилов. Поэтому авторы обратились непосредственно к возможности того, что воспалительный ответ на MSU может зависеть от состояния дифференцировки моноцитов в макрофаги.

   Исследователи  изучили панель линий мышиных моноцитов и макрофагов, представляющих различные стадии созревания макрофагов. Порядок линий клеток в линии дифференцировки был установлен путем изучения экспрессии маркеров макрофагов F4 / 80 и BM 8. Линии клеток выявили тесную корреляцию между уровнем экспрессии этих поверхностных маркеров и способностью поглощать кристаллы MSU , FNO-α производства в ответ на кристаллах МSU, однако, не был связан с фагоцитарной способности, в том , что наиболее FNO-α был синтезирован клетками на промежуточной стадии дифференцировки. Напротив, два наиболее зрелых типа клеток макрофагов, MH-S и IC21, не смогли секретировать TNF-α, несмотря на то, что они наиболее эффективны при фагоцитозе кристаллов MSU. Кроме того, после поглощения кристаллов MSU супернатанты из этих зрелых клеточных линий макрофагов не смогли активировать эндотелиальные клетки. Напротив, супернатанты из частично дифференцированной клеточной линии RAW264.7 индуцировали экспрессию эндотелиальных клеток ICAM-1 через TNF-α- и IL-1β-зависимый механизм в соответствии с предыдущим исследованием. 

    Стимуляция клеточной линии макрофагов IC21 липополисахаридом или зимозаном приводила к легко обнаруживаемой продукции TNF-α, что означает, что отсутствие реакции на кристаллы MSU не было связано с неспособностью продуцировать провоспалительные цитокины. Кроме того, инкубация клеток IC21 вместе с зимозаном и MSU приводила к подавлению ответа зимозана, что позволяет предположить, что кристаллы MSU могут стимулировать активный подавляющий ответ. Поскольку подавляющая активность проходила через полупроницаемый фильтр, это, по-видимому, связано с выделением еще не охарактеризованных растворимых факторов.

  Авторы распространили эти эксперименты на человеческие моноциты и макрофаги, дифференцированные in vitro, и получили очень похожие результаты. Принимая во внимание, что свежеизолированные моноциты реагировали на кристаллы MSU, высвобождая IL-1β, TNF-α и IL-6, дифференцированные макрофаги из одних и тех же индивидуальных интернализованных кристаллов, но не могли генерировать эти цитокины или любой другой фактор, способный активировать экспрессию молекулы адгезии эндотелиальных клеток. Опять же, макрофаги человека были такими же чувствительными, как и моноциты, в отношении высвобождения TNF-α после стимуляции зимозаном. Текущая работа позволяет более детально установить профиль провоспалительных и противовоспалительных генов, активированных в моноцитах и ​​макрофагах после поглощения кристаллов MSU, и охарактеризовать задействованные рецепторы и сигнальные механизмы.

   На основе этой работы авторы  предложили модель подагры , в котором критический фактор острого приступа определяется не только наличием свободных кристаллов МSU, но и наличие в экстраваскулярных тканях недавно попавших туда моноцитов крови. У людей с гиперурикемией бессимптомное состояние может поддерживаться бесшумным удалением тканевыми макрофагами небольших количеств кристаллов по мере их выпадения. Однако рекрутирование свежих моноцитов может происходить в ответ на любой из хорошо установленных преципитатов острой подагры (например, травма, инфекция), возможно, вследствие начальной активации эндотелия путем дегрануляции тучных клеток и высвобождения TNF-α. Поглощение кристаллов моноцитами приводит к выработке IL-1β и TNF-α, который, в свою очередь, активирует эндотелий и усиливает воспалительный ответ за счет рекрутирования нейтрофилов и других моноцитов.  Наблюдения изменений на коже свиньи позволяют предположить, что петля положительной обратной связи вначале прерывается на уровне эндотелия сосудов с помощью механизмов, блокирующих дальнейшее проникновение лейкоцитов в ткани. Впоследствии, подавление активации лейкоцитов в постмиграционной ткани и дальнейшая разработка эндотелиальных активирующих факторов может быть достигнута невоспалительным удалением свободных кристаллов макрофагами, которые дифференцировались от рекрутированных моноцитов, возможно, с участием высвобождения противовоспалительных медиаторов. Тем не менее, макрофаги могут быть не совсем невинными партнерами, поскольку остается возможным, что механизмы разрешения, индуцируемые кристаллами MSU, могут включать факторы, участвующие в восстановлении тканей (такие как протеазы и факторы роста), которые могут способствовать разрушительным изменениям, связанным с тофий.

   Отношение между активацией эндотелия и дифференцировкой моноцитов и макрофагов, выявленное при подагре, предоставляет платформу для понимания кинетики воспаления при ревматических заболеваниях, которые не являются самоограничивающимися. При иммуноопосредованных состояниях, таких как ревматоидный артрит (RA), ряд воздействий может ограничивать подавляющую активность эндотелия и макрофагов. Во-первых, в синовии RA посткапиллярные венулы напоминают высокоэндотелиальные венулы, обнаруженные в периферических лимфоидных органах . Эти высокоэндотелиальные венулы имеют пухлые, кубоидальные / столбчатые эндотелиальные клетки и приспособлены для поддержания устойчивого, а не самоограниченного рекрутирования лейкоцитов . Эти и другие морфологические изменения, характерные для лимфоидного неогенеза, наиболее вероятно находятся под контролем хемоаттрактанта В-лимфоцитов (BLC / CXCL13). 

   Вторым важным отличием в RА является наличие иммунных комплексов и / или комплемента, которые могут подорвать невоспалительные свойства дифференцированных макрофагов, способствуя фагоцитозу через различные рецепторы. Таким образом, опсоническая сыворотка, как было показано, обращает вспять невоспалительную программу апоптотического удаления нейтрофилов макрофагами, вместо этого делая процесс провоспалительным. Иммунные комплексы при RА могут напрямую вызывать высвобождение провоспалительных цитокинов, таких как TNF-α, путем связывания с рецептором иммуноглобулина, Fc-гамма-рецептором RA. Третье различие между самоограничивающимся воспалительным ответом при подагре и RA заключается в том, что преобладающая среда хемокинов / цитокинов ревматоидного синовиума может способствовать дифференцировке предшественников в дендритные клетки, а не в фенотип тканевых макрофагов. Ревматоидный синовиум богат цитокинами, такими как IL-4 и IL-15 , которые искажают дифференцировку моноцитов в сторону дендритных клеток , но беден цитокинами, такими как M-CSF, которые способствуют макрофагальной конечной точке. 

   Модель, изложенная выше, теперь может служить шаблоном для рассмотрения треугольных взаимодействий между моноцитами, макрофагами и эндотелиальными клетками, а также для определения влияния дифференцировки моноцитов на макрофаги на контроль других воспалительных реакций, вызываемых потенциально вредными частицами. Из множества ревматологических синдромов, связанных с различными кристаллами, ясно, что биологические эффекты осаждения кристаллов варьируются в зависимости от вида вовлеченных кристаллов. Это, в свою очередь, связано с дифференциальными клеточными реакциями, возможно, связано с четким использованием рецепторов клеточной поверхности. Детальный анализ различных рецепторных и сигнальных путей, участвующих в клеточных реакциях на разные кристаллы, может дать важную информацию, которая поможет нам понять механизмы, лежащие в основе гетерогенности связанных с кристаллами ревматических заболеваний.

 У людей с гиперурикемией бессимптомное состояние может поддерживаться бесшумным удалением тканевыми макрофагами небольших количеств кристаллов по мере их выпадения. Однако рекрутирование свежих моноцитов может происходить в ответ на любой из хорошо установленных преципитатов острой подагры (например, травма, инфекция), возможно, вследствие начальной активации эндотелия путем дегрануляции тучных клеток и высвобождения TNF-α. Поглощение кристаллов моноцитами приводит к выработке IL-1β и TNF-α, который, в свою очередь, активирует эндотелий и усиливает воспалительный ответ за счет рекрутирования нейтрофилов и других моноцитов. Наши наблюдения на коже свиньи позволяют предположить, что петля положительной обратной связи вначале прерывается на уровне эндотелия сосудов с помощью механизмов, блокирующих дальнейшее проникновение лейкоцитов в ткани. Впоследствии, подавление активации лейкоцитов в постмиграционной ткани и дальнейшая разработка эндотелиальных активирующих факторов может быть достигнута невоспалительным удалением свободных кристаллов макрофагами, которые дифференцировались от рекрутированных моноцитов, возможно, с участием высвобождения противовоспалительных медиаторов. Тем не менее, макрофаги могут быть не совсем невинными партнерами, поскольку остается возможным, что механизмы разрешения, индуцируемые кристаллами MSU, могут включать факторы, участвующие в восстановлении тканей (такие как протеазы и факторы роста), которые могут способствовать разрушительным изменениям, связанным с тофий.

   Напротив, два наиболее зрелых типа клеток макрофагов, MH-S и IC21, не смогли секретировать TNF-α, несмотря на то, что они наиболее эффективны при фагоцитозе кристаллов MSU. Кроме того, после поглощения кристаллов MSU супернатанты из этих зрелых клеточных линий макрофагов не смогли активировать эндотелиальные клетки. Напротив, супернатанты из частично дифференцированной клеточной линии RAW264.7 индуцировали экспрессию эндотелиальных клеток ICAM-1 через TNF-α- и IL-1β-зависимый механизм в соответствии с нашим предыдущим исследованием

Неожиданно фаза экспрессии E-селектина и рекрутирования лейкоцитов была достаточно короткой, и оба вернулись к исходному уровню к пику эритемы через 24 часа. Через 24 часа эритема рассосалась, несмотря на продолжающееся присутствие кристаллов MSU в коже. При рассмотрении связи между активацией эндотелия и переносом лейкоцитов и кинетикой воспалительного ответа можно сделать три вывода. Во-первых, начальная активация эндотелия и рекрутирование лейкоцитов были тесно связаны. Во-вторых, временная природа экспрессии эндотелиального E-селектина и рекрутирования лейкоцитов, по-видимому, ограничивают проникновение лейкоцитов в ткани до относительно ранней стадии ответа. Наконец, предполагая, что эритема является отражением постмиграционной активации лейкоцитов,