Опубликовано
Каждый тип лейкоцитов играет свою роль в иммунной системе организма, который активируется тогда, когда иммунная система начинает реагировать на стрессоры и/или болезни.
Новые парадигмы трансляционных исследований сосредоточены на глубоком понимании всех аспектов иммунной системы человека в ответ на болезни, вакцинацию или терапию. Чтобы получить эти знания, необходимы скоординированные, всесторонние оценки геномики, протеомики и цитомики. Одним из компонентов этой оценки является комплексное иммунофенотипирование лейкоцитов (CLIP), которое не только обеспечивает глубокое и широкое описание всей иммунной системы в любой момент, но также охватывает все линии лейкоцитов, включая состояния активации, функциональные маркеры и сигнальные молекулы. Этот комплексный подход к иммунофенотипированию, в дополнение ко всем известным подмножествам лейкоцитов, должен также включать маркеры активации, внутриклеточные цитокины, фосфорилированные сигнальные белки и, в некоторых случаях, анализ тетрамеров.
В 1997 г. Van den Hove L., et al. опубликовали исследование в Cytometry , в котором сообщалось о многопараметрическом подходе к изучению лимфоцитов периферической крови. Авторы использовали многомерный анализ, позволивший представлять определенное количество наблюдений (субъектов) и многочисленные переменные (параметры) в двумерном графике.
Таким образом, уже несколько лет назад возникла необходимость проанализировать различные параметры и представить их графически, чтобы лучше изучить взимосвязи и иметь представление об этих параметрах в целом.
Иммунная система представляет собой сложную сеть многочисленных клеточных компонентов, которые взаимодействуют друг с другом как напрямую, так и через растворимые медиаторы. Это динамичная, «интеллектуальная» система, реагирующая на раздражители, адаптируется к ним и запоминает; кроме того, она интегрирована с нейроэндокринной системой. Учитывая, что эта система обладает функциями «распознавания» и «памяти», она чрезвычайно чувствительна к различным типам внешних воздействий ( стимулов, раздражителей, агентов и т.д.), которые она запоминает в течение не только определенного периода, но иногда и на всю жизнь. Эти характеристики придают системе заметную динамику, особенно в первые десятилетия жизни, когда «антигенные переживания» (стимулы) многочисленны и являются «новыми».
Подход к иммунологической диагностике обычно заключается в измерении ряда параметров, связанных, главным образом, с типами клеток их состоянием активности в крови, которые количественно определены преимущественно с помощью проточной цитометрии. В этом контексте изучение популяций лимфоцитов и, тем более, субпопуляций, поскольку они более тесно связаны с различными функциями, является важным инструментом для оценки динамики иммунной системы и ее нарушений. Возможность одновременного изучения различных маркеров клонов вместе с функциональными маркерами позволяет собрать большое количество информации о функциях клеток, причем, этот массив данных трудно оценить.
Количество и анализ отдельных параметров сам по себе недостаточен для выявления «динамического» состояния систем,на самом деле, требующей очень сложной многопараметрической обработки и оперативного моделирования (область «системной биологии»).
Информация, которую можно получить в результате иммунофенотипирования, огромна и разнообразна. Можно привести лишь несколько примеров заболеваний человека. Во-первых, высокая пролиферативная способность и продукция множества цитокинов HIV-специфичными CD8 + T-клетками связана с отсутствием прогрессирования у пациентов с HIV, тогда как снижение числа CD4 + T-клеток, инвертированное соотношение CD4 + к CD8 + T-клеткам и увеличение количества CD38 + CD8 + Т-клеток свидетельствует о прогрессировании заболевания. Во-вторых, диагностике и мониторингу лейкемии и лимфомы помогает иммунофенотипирование крови и костного мозга. В-третьих, старение связано с увеличением количества CD28 эффекторных Т-клеток поздней стадии и увеличение количества олигоклональных цитомегаловирус-специфических Т-клеток.
Обычно исследователи используют многопараметрическую диагностическую систему с использованием маркеров линии (CD45, CD3, CD4, CD8, CD19, CD16 и CD56) и функциональных маркеров, способных обнаруживать функциональные состояния различных субпопуляций лимфоцитов. В частности, маркеры состояния активации (HLA-DR, CD38, CD23), наивных клеток / клеток памяти (CD5, CD45RA, CD28, CD27) и эффекторной функции (CD57) используются для сбора информации о поведении иммунной системы, в нормальных условиях или при наличии нарушений, прямо или косвенно связанных с иммунной функцией.
Изменчивость клеточных компонентов, в особенности субпопуляций лимфоцитов представляет собой меру динамичности системы, особенно зависящей от «антигенного опыта», накапливающегося с течением времени, именно по этой причине возраст субъекта является фактором первостепенной важности. Педиатрические референтные значения не всегда сопоставимы для диагностических и научных целей, а в некоторых случаях могут быть противоречивыми. Еще одним препятствием для сравнительного многопараметрического анализа является ограниченная доступность контрольных значений для большинства субпопуляций лимфоцитов. Действительно, для многих маркеров вообще нет эталонных значений, особенно для детей.
Очень низкие уровни CD4 + лимфоцитов частично обусловлены выраженной лейкопенией или лимфопенией, частично синдромами врожденного иммунодефицита, и, возможно, частично, и HIV-инфекции.
Существует широкий спектр методов, с помощью которых можно оценить состояние и функциональные возможности иммунной системы, но не существует ни одного маркера ни ее состояния, ни функциональных возможностей.
Активность многих отдельных компонентов иммунной системы можно измерить, чаще всего, изучая этот компонент в контролируемых условиях ex vivo (т.е. вне организма). Также возможно изучение скоординированного иммунного ответа in vivo, обычно на контролируемое заражение (например, вакцинация, внутрикожное применение антигена).
На животных можно исследовать функциональные реакции иммунных клеток, выделенных из крови, тимуса, селезенки, лимфатических узлов, кишечной лимфоидной ткани, брюшной полости и, в некоторых случаях, из костного мозга, легких и печени.
Исследования на людях часто ограничиваются возможностью отбора проб только крови и внешних выделений, таких как слюна, хотя в некоторых экспериментальных условиях можно сделать биопсию кишечника, включая иммунную ткань, или собрать жидкость бронхоальвеолярного лаважа.
В большинстве случаев можно измерить количество циркулирующих клеток, их состояние активации и их реакцию на заражение ex vivo. Однако следует помнить, что большинство иммунных клеток не находятся в кровотоке; например, только 2% от общего количества лимфоцитов циркулируют в любой момент времени.
Нормальные диапазоныустановлены для числа циркулирующих иммунных клеток и циркулирующих концентраций Ig, но нормальных диапазонов для функциональных ответов иммунных клеток не существует.
Комбинируя «пятна» антител, можно получить очень подробную информацию о подтипах присутствующих клеток. Отношение CD4 + к CD8 + клеткам часто обозначается как параметр относительного количества Th и T-супрессоров / цитотоксических клеток, но истинное значение этого соотношения неясно. Отношение памяти к наивным клеткам (CD45RO: CD45RA) считается показателем долгосрочной активации иммунной системы.
Для комплексного иммунофенотипирования лейкоциты, меченные флуорохром-конъюгированными антителами, идентифицируют и определяют количественно с помощью проточной цитометрии с 10 цветами (FCM). Тем не менее, следует помнить, что количество подмножеств лейкоцитов варьируется в зависимости от возраста, пола и этнической принадлежности.
Состав клеток в крови является индивидуальной особенностью, которая стабильна у здоровых взрослых в течение недель или месяцев. Напротив, в очень раннем возрасте состав клеток резко меняется в ответ на воздействие окружающей среды, что указывает на критический период развития, когда формируется уникальный состав клеток индивидуума. В отличие от сообщений о стабильности взрослой иммунной системы, специфические клеточные популяции изменяются параллельно с ежегодными сезонами, а также частота других клеток, определяемая по паттернам экспрессии генов крови, также, меняется в зависимости от сезона. На самом деле нет никаких существенных сдвигов в глобальном составе иммунных клеток между месяцами года, что позволяет предположить, что общая дисперсия иммунитета не сильно зависит от сезона.
Исследователи выявили наиболее сильные положительные корреляции с отклонением от стандартных показателей иммунной системы для популяций эффекторной памяти CD4 + и популяций CD8 + T-EMRA, а также для популяции В-клеток с переключенной и не переключаемой памятью, которые отрицательно коррелировали с отклонениями от нормы. Основная кривая может описывать глобальную иммунную изменчивость и выявлять такие взаимосвязи, как противоположные отношения между популяциями эффекторных Т- и В-клеток памяти у здоровых взрослых.
Наиболее различающиеся клеточные популяции между мужчинами и женщинами наивные CD4 +Т-клетки, более высокие у женщин, в то время как активированные и экспрессирующие антиген CD8 + Т-клетки более многочисленны у мужчин.
Исследователи обнаружили сильные негативные ассоциации между уровнями IL- 6 в плазме и Т-клетками центральной памяти, как CD4 +, так и CD8 + , а также цитотоксическими CD56, NK-клетками, которые, как известно, экспрессируют CD4 при активации.
В отличие от общих белковых ассоциаций для Т-клеток центральной памяти, три основные популяции моноцитов связаны с различными белками плазмы, что позволяет предположить, что модуляция специфических субпопуляций может быть возможной. Почти 80% дисперсии содержания Т-клеток центральной памяти можно объяснить концентрацией 21 белка плазмы, тогда как более маргинальный набор из 4 белков, ассоциированных с CD56 + Т-клетками, объясняет более 20% его дисперсии.
T. Lakshmikanth et.al ( 2020) обнаружили положительную корреляцию между маркерами плохого метаболического здоровья, такими как Аро-В плазмы, триглицериды (TG) и холестерин липопротеины низкой плотности, и наоборот, отрицательной связью между иммунной изменчивостью с течением времени («среднее расстояние Эйчисона» ) и маркерами метаболического здоровья, такие как липопротеины высокой плотности и Аро-А1. Кроме того, высокочувствительный тропонин Т - белок выделяющийся из сердечной мышцы и маркер сердечно-сосудистых заболеваний положительно коррелировал с иммунной изменчивостью.
RBC и WBC положительно связаны с высокой иммунной изменчивостью во времени. При рассмотрении белков плазмы, коррелирующих с изменчивостью клеток с течением времени, CCL18 был одним из главных хитов, и ранее показано, что этот хемокин сильно экспрессируется макрофагами при атеросклеротических поражениях ( Hagg et.al., 2009) и коррелирует со степенью ишемическая болезнь сердца у пациентов. Эти данные свидетельствуют о том, что вариабельность иммунной системы является индивидуальной особенностью, которая не объясняется явными реакциями на инфекции, а ассоциируется с маркерами плохого метаболического здоровья.
Таким образом, иммунофенотипирование лимфоцитов крови является важным инструментом в диагностике гематологических и иммунологических нарушений.
СD номенклатура
Клетки, которые различаются по функциям, имеют различные молекулярные структуры в своих мембранах. Эти структуры могут служить маркерами для конкретных типов клеток и распознаны специфическими антисыворотками против маркеров.
Молекулы CD - поверхностные молекулы, экспрессирующиеся на клетках иммунной системы, играют ключевую роль в иммунном межклеточном взаимодействии и реакции на микроокружение. Эти молекулы являются важными маркерами для идентификации и выделения подмножеств лейкоцитов (Kalina T., et.al., 2019). Именно , поверхностные молекулы (CD) имеют решающее значение для восприятия опасных изменений окружающей среды, опосредуют клеточную адгезию и связь между клетками как внутри иммунной системы, так и со стромой.
К CD относятся рецепторы, транспортеры, каналы, молекулы (белки) адгезии, связанные с мембраной ферменты и гликаны, которые играют разнообразные роли в развитии, активации и дифференцировке лейкоцитов.
Молекулы CD
Рецепторы
Транспортеры
Каналы
Белки адгезии
Ферменты
Гликаны
Сложность поверхностно-экспрессируемых белков, подчеркивается тем фактом, что приблизительно 26% генов человека кодируют трансмембранные белки (~ 5500). Однако, последние оценки in silico предсказывают, что 2886 белков фактически экспрессируются на наружной клеточной мембране, т.е. на поверхности клеток.
За последние четыре десятилетия благодаря производству моноклональных антител (mAb) было обнаружено огромное количество молекул клеточной поверхности. Эти mAb, наряду с развитием многоцветного проточного цитометрического анализа, сыграли важную роль в определении их экспрессии и функции.
Семинары по дифференцировке антигенов лейкоцитов человека (HLDA) позволили охарактеризовать и официально обозначить более 400 поверхностных молекул, известных как молекулы CD.
Сегодня CD номенклатура обеспечивает единую систему обозначения для моноклональных антител (mAb), а также для молекул клеточной поверхности, которые они распознают.
Важно отметить, что анализ молекул CD, известный как иммунофенотипирование, является фундаментальным компонентом для диагностики, классификации и отслеживания гематологических злокачественных новообразований и иммунодефицитов, а также мониторинга нарушений иммунной системы, например, аутоиммунных заболеваний. В то же время, за исключением подсчета CD4+ Т – клеток для иммунного мониторинга у пациентов с HIV и иммунофенотипирования лейкозов и лимфом, проточная цитометрия в основном проводится в исследовательских условиях.
Иммунофенотипирование ( анализ молекул CD)
Диагностика
Классификация
Мониторинг гематологических злокачественных новообразований
Мониторинг иммунодефицитов
Мониторинг аутоиммунных заболеваний
Мониторинг инфекционных заболеваний
Из 111 протестированных CD-маркеров 31 значительно отличались по ABC между любыми двумя из трех подмножеств . Примечательно, что множество интегринов (CD11b, CD49e) и другие молекулы адгезии (CD33, CD62P), а также молекула презентации антигена CD1d были специфически подавлены на неклассических моноцитах по сравнению с классическими и промежуточными подмножествами.
По определению, CD16 (FcγRIII) активирован на промежуточных и неклассических моноцитах. Напротив, CD64 (FcγRI) специфически подавлен на неклассических моноцитах, тогда как все подгруппы экспрессировали относительно сходные уровни CD32 (FcγRIIa и FcγRIIb). Антиген CD35 (рецептор комплемента 1) специфически подавлялся на неклассических моноцитах. Внутри семейства тетраспанинов экспрессия CD63 была особенно высокой на классических моноцитах, а уровни экспрессии CD9 и CD82 были значительно снижены на неклассических моноцитах, тогда как для CD37, CD53 и CD81 различий не наблюдалось.
Популяция одноядерных клеток периферической крови состоит из CD4 + и CD8 + Т- клеток, В - клеток и NK - клеток, CD14 + моноцитов, базофилов, нейтрофилов, эозинофилов и дендритных клеток. Внутри клеток CD3 + (Т- клетки ) выделены три основные линии (TCRγδ +, CD4 + и CD8 +).
СD16 и CD56
В последние годы было показано, что NK-клетки гораздо более гетерогенны, чем считалось ранее, с большим разнообразием активирующих и ингибирующих рецепторов, экспрессируемых перекрывающимися субпопуляциями клеток, которые широко варьируют у разных индивидуумов. Однако на более базовом уровне NK-клетки можно разделить на две основные категории только на основе маркеров CD16 и CD56. Подавляющее большинство NK-клеток периферической крови имеют CD16 + CD56 low , тогда как меньшая часть - CD16 + CD56 h
Эти популяции клеток различаются по функциям и тканевой локализации, и было показано, что последняя подгруппа является промежуточным фенотипом, который может давать начало первой подгруппе
СD19
Абсолютное количество CD19 В – лимфоцитов увеличивается в два раза сразу после рождения , оставаясь стабильным до двухлетнего возраста, а затем постепенно снижается в 6,5 раз с двух лет до взрослого состояния.
Т - лимфоциты ( CD3)
Основные подмножества Т-клеток можно определить по экспрессии CD4 и CD8 вместе, например, с CCR7 и CD45RA.
Панель, содержащая CD3 (для определения Т-клеток), CD4, CD8, CD45RA и CCR7, кажется наиболее подходящей для различения наивной, центральной памяти, эффекторной памяти и эффекторных CD4 + и CD8 + .Т-клеток. С добавлением маркеров активации, таких как CD38 и HLA-DR, также можно определить активированные подмножества каждого из этих типов клеток
Т – лимфоциты (СD3) увеличиваются в 1,5 раза сразу после рождения и уменьшаются в три раза с двухлетнего возраста до взрослого.
Большинство Т-клеток несут α- и β-цепи в своем Т-клеточном рецепторе (TCR). Однако существует популяция Т-клеток, в которых TCR образованы γ- и δ-цепями. Эти клетки, гамма-дельта-Т-клетки, связываются с BTN2A1 и BTN3A1 и значительно обогащены эпителием
Гамма-дельта-Т-клетки регулируют иммунные ответы с помощью различных механизмов, включая подавление функций эффекторных Т-клеток и Тh1- клеток, блокирование притока нейтрофилов и регуляцию активности антигенпрезентирующих клеток.
Стадии развития и дифференцировки Т – клеток
Известно, что предшественники CD4 - CD8 - Т-клеток ( дважды отрицательные клетки ) мигрируют в тимус, где они проходят следующие фенотипические стадии: CD44 + CD25 - (DN1), CD44 + CD25 + (DN2), CD44 - CD25 + (DN3) и CD44. - CD25 - (DN4), за которым следует развитие клеток DN4 в дважды положительные CD4 + CD8 + Т-клетки. После взаимодействия с комплексами собственного пептида -MHC класса I тимоциты становятся CD8 + Т-клетками. Тимоциты, взаимодействуя с комплексами собственного пептида-МНС класса II и , в конце концов, становятся CD4 + Т-клетками.
Стадии развития и дифференцировки Т – клеток в тимусе
СD4 - , CD8 – ( миграция в тимус)
CD44 + CD25 - (DN1)
CD44 + CD25 + (DN2)
CD44 - CD25 + (DN3)
CD44. - CD25 - (DN4),
CD4 + ( взаимодейтсвие с MCH класса II ) CD8 + (взаимодействие с MCH класса I)
Заражение различными патогенами вызывает активацию и пролиферацию наивных Т-клеток, которые дифференцируются в клоны с эффекторной судьбой и судьбой памяти.
СD4 + Т - клетки
CD4 представляет собой корецептор, который связывает молекулы главного комплекса гистосовместимости (MHC) класса II на антигенпрезентирующих клетках (APC), последние представляют пептиды TCR, присутствующие на T-клетке (Glatzova D., and Cebecauer M., 2019).
Молекулы MHC класса II содержат гетеродимер α- и β-цепей. Эти цепи при сборке образуют пептидсвязывающую щель, в которой презентируется антиген. У людей три генных локуса кодируют молекулы MHC класса II — HLA-DR, -DQ и DP (Blum G., et al., 2013), что позволяет экспрессировать большое разнообразие пептидов. Молекулы МНС класса II синтезируются в эндоплазматическом ретикулуме (ER) и транспортируются в эндосомы с присутствующей инвариантной цепью для стабилизации структуры через аппарат Гольджи.
Пептиды, образующиеся в результате протеолиза эндоцитированных белков, заменяются на фрагмент, ассоциированный с классом II инвариантный пептид (CLIP), который остается в пептидсвязывающей щели собранной молекулы МНС класса II в поздних эндосомах. Затем загруженный комплекс транспортируется на поверхность клетки, что позволяет CD4+ Т-клеткам распознавать белки экзогенного происхождения.
Взаимодействие CD4+ Т-клеток с комплексами МНС класса II на АPC приводит к образованию комплекса, известного как «иммунологический синапс», который предшествует активации Т-клеток. Формирование синапса позволяет кластеризовать различные костимулирующие молекулы, включая CD28 и CD40L, которые экспрессируются Т-клеткой и необходимы для успешной внутриклеточной передачи сигналов и последующей активации CD4+ Т-клетки (Glatzova D., and Cebecauer M., 2019).
После активации популяция CD4+ Т-клеток увеличивается, а затем, как правило, сокращается до образования популяции памяти. Генерация долгоживущих антигенспецифических CD4+ Т-клеток памяти включает интеграцию множества клеточных и цитокиновых процессов. Т-клетки памяти CD4+ можно разделить на несколько различных функциональных подмножеств, который включает Т-хелперные 1 (Th1) и Т-регуляторные (Treg) клеточные типы.
Генерация различных подмножеств является результатом локализации CD4+ T-клеток, локальной цитокиновой среды и экспрессии клеточных транскрипционных факторов. Например, дифференцировка в субпопуляцию Th1, которая характеризуется продукцией противовирусных цитокинов, таких как IFN-γ, происходит в результате воздействия IL-12, IFN-γ и экспрессии фактора транскрипции T-bet (Zhu G., et al., 2010)
Популяции CD4+ Т-клеток памяти и эффекторов также можно определить в соответствии с их статусом дифференцировки, на который указывает экспрессия или потеря экспрессии различных маркеров клеточной поверхности. Общие подмножества памяти включают центральную память (TCM ), эффекторная память (TGM), реэкспрессирующих эффекторных клеток памяти CD45RA (TEMRA) и подмножества резидентной памяти тканей (TRM) (Nguyen K., et al., 2019).
Зрелые клетки Th1 продуцируют IFN-γ, который может активировать молекулы MHC класса I и II в клетках в локальном микроокружении, а клетки обладают противовирусными свойствами и защищают от внутриклеточных бактерий и грибков. Принимая во внимание, что клетки Th2 обычно секретируют IL-4, IL-5 и IL-13 и активны против внеклеточных паразитов и участвуют в аллергических реакциях. Клетки Th9 играют важную роль в опосредовании антипаразитарного иммунного ответа, секретируемый IL-9 активирует тучные клетки и увеличивает функции базофилов и эозинофилов. Т-фолликулярные хелперные клетки (Tfh) специализируются на оказании помощи В-клеткам и содействии в формировании зародышевого центра, а зрелые клетки Th17 помогают в защите от внеклеточных бактерий и грибков. Клетки Treg характеризуются экспрессией фактора транскрипции Foxp3 и помогают контролировать активацию иммунного ответа, было показано, что клетки Th22 играют роль в опосредовании иммунных ответов в коже.
CD4+ клетки
Второе звено адаптивного Т – клеточного иммунитета
После активации популяция увеличивается, а затем сокращается до образования популяции клеток памяти:
Опосредуют противоопухолевой иммунитет ( помощь D8+ CTL, ответы антител, секреция эффекторных цитокинов IFNγ и TNFα)
Под влиянием конкретных стимулов дифференцируются на различные подтипы: Th1, Th2 (Th2A), Th9, Th17, Th22, Treg
CD4 + T-клетки претерпевают динамические и экстенсивные изменения в транскрипционном и эпигенетическом ландшафтах во время спецификации клеточных судеб от бипотентных CD4 + CD8 + double-positive (DP) предшественников в тимусе. Одной из критических эпигенетических меток, которая динамически модулируется в CD4 + T-клетках, является метилирование DNA, что иллюстрируется обильным присутствием первого интермедиата активного деметилирования DNA - 5hmC, в недавно определенных CD4 + CD8 – тимоцитах. Большая часть этих меток 5hmC встречается преимущественно в межгенных и внутригенных областях активных генов, но истощена в сайтах начала транскрипции (TSS)( Tsagaratou A., et.al., 2014).
CD4 + Т-клетки - очень универсальные полифункциональные клетки, которые составляют второе звено адаптивного Т-клеточного иммунитета наряду с их сестринской линией CD8 + цитотоксических Т-клеток. CD4 + Т-клетки могут дифференцироваться в один из нескольких различных функциональных подтипов в ответ на контекстно-зависимые сигналы, что, в свою очередь, позволяет им оказывать «помощь» соответствующим эффекторным иммунным клеткам в их основной роли центральных координаторов иммунного ответа.
CD4 + T-клетки в первую очередь опосредуют противоопухолевый иммунитет, помогая CD8 + CTL и ответам антител, а также посредством секреции эффекторных цитокинов, таких как IFNγ и TNFα, и, в меньшей степени, конкретных контекстах, посредством прямой цитотоксичности против опухолевых клеток. Самыми ранними попытками индуцировать ответы CD4 + Т-клеток против опухолей были попытки генерировать Th1 -поляризованные CD4 + Т-клетки путем вакцинации пептидными эпитопами
В зависимости от конкретных стимулов CD4 + Т-клетки могут дифференцироваться на различные подтипы, включая хелперные Th 1, Th 2 и Th 17 клетки и регуляторные T-клетки (Treg). Подмножество Th 2-клеток дифференцируется в Th 2A-клетки, связанные с аллергическим заболеванием, с фенотипом CD45RB с низким CD27 - и коэкспрессией хемоаттрактантного рецептора CRTh 2 - маркера NK – клеток CD161 и рецептора хоминга CD49d
CD4 + Т-клетки играют решающую роль в развитии и поддержании эффективного противоопухолевого иммунитета, даже при иммунотерапии рака, специально разработанной для активации ответа CD8 + CTL - ответа.
Факторами, влияющими на количество CD4 и, соответственно, соотношение CD4 / CD8, являются некоторые вирусные инфекции, туберкулез, прием кортикостероидов, сезонные / суточные колебания и вариации в анализах CD4.
Увеличение абсолютного и относительного количества CD4+ наблюдается при аутоиммунных заболеваниях, может быть при аллергических реакциях, некоторых инфекционных заболеваниях. Это увеличение свидетельствует о стимуляции иммунной системы на антиген и служит подтверждением гиперреактивных синдромов.
Снижение абсолютного и относительного количества СD4 + T - клеток свидетельствует о гипореактивном синдроме с нарушением регуляторного звена иммунитета, что является патогномичным признаком для HIV-инфекции; встречается при хронических заболеваниях (бронхитах, пневмониях и т.д.), солидных опухолях.
У здоровых взрослых CD4+ Т-клетки обычно составляют большинство присутствующих Т-клеток. Однако цитомегаловирусная инфекция может привести к нарушению состава циркулирующих популяций Т-клеток (Chidrawar S., et al., 2009).
Абсолютный размер субпопуляций CD3/CD4 Т – лимфоцитов следует той же схеме, что и общая популяция CD3+, однако , было показано, что количество CD4+ несколько снижается у пожилых людей.
Аутореактивные, чаще всего инфекционные CD4 + Т-клетки имеют решающее значение для индукции миокардита.
Т – клетки памяти
Т-клетки памяти различаются по экспрессии поверхностных рецепторов, эффекторным способностям и способностям транспортировки. Существует четыре основных подмножества Т-клеток памяти: центральная память, эффекторная память, резидентная память в тканях и стволовые Т-клетки памяти.
Классификация Т – клеток памяти
Т – клетки центральной памяти (CD62L, CCR7)
Т – клетки эффекторной памяти (CD45RA)
Т – клетки резидентной памяти
Стволовые Т – клетки памяти (CXCR3, CD95)
Множество сигналов регулируют дифференцировку CD4 + Т-клеток в центральные и периферические клетки памяти. CD4 + T центральные клетки памяти экспрессируют CD62L и CCR7, которые важны для их миграции . Клетки памяти периферических Т-стволовых клеток экспрессируют молекулы CXCR3 и CD95. Кроме того, как наивные, так и подгруппы Т-клеток памяти экспрессируют множество функциональных молекул.
Регуляторные клетки (CD4+CD25+ )
Регуляторные Т клетки (Treg) идентифицированы и описаны как подавляющие иммунитет Т-клетки.
Регуляторные CD4 + CD25 + Т-клетки представляют собой специфическую популяцию Т-клеток, ответственную за иммунный гомеостаз и толерантность. Их частота в кровотоке может сильно различаться в зависимости от состояния или стадии заболевания. Treg экспрессируют транскрипционный фактор FOXP3, необходимый для активного подавления аутоиммунитета
Как и другие Т-клетки, Treg в основном развиваются в тимусе, но могут развиваться и на периферии. Treg подавляют аутоиммунные популяции Teff, а также APC, участвующие в праймировании и активации с помощью различных механизмов, зависящих от межклеточных независимых контактов.
Treg продуцируют ингибирующие цитокины, такие как трансформирующий фактор роста бета (TGF - β ) и IL-10, или экспрессируют поверхностные молекулы с иммунодепрессивными свойствами, такие как CTLA-4 или глюкокортикоид-индуцированный рецептор TNF (GITR), модулирующий иммунные процессы. Экспансия регуляторных клеток считается важным механизмом контроля аутоиммунитета.
CD8+ Т – клетки
Вторая основная группа Т-клеток, CD8 + Т-клетки, опосредует прямое уничтожение антигенпрезентирующих клеток-мишеней. Наивные CD8 + Т-клетки активируются при распознавании антигенов, представленных MHC класса I, на дендритных клетках в селезенке или лимфатических узлах.
СD3+./СD8+ Т – лимфоцитов остается стабильным с рождения лдо 2-х летнего возраста с последующим постепенным трехкратном уменьшением у взрослых людей.
Повышение выявляется практически при всех хронических инфекциях, вирусных, бактериальных, протозойных инфекциях. Является характерным для ВИЧ-инфекции. Снижение наблюдается при вирусных гепатитах, герпесе, аутоиммунных заболеваниях.
Активированные CD8 + Т-клетки размножаются и становятся эффекторными CD8 + Т-клетками. CD8 + Т-клетки обычно оценивают во время исследования на предмет инфильтрирующих опухоль Т-клеток.
СD4+ и CD8+
Парный анализ параллельных стадий созревания между линиями CD4 и CD8 для маркеров со значимостью более 0,01 и изменением не менее чем в 10 раз выявил стабильно более высокую экспрессию CD59 на Т-клетках CD4 (все стадии, кроме TemRA; CD45RA + CD27–) . Наоборот, маркер «старения» CD57 и тетраспанина CD63 были выше на CD8 Т-клетках на стадии центральной памяти (Tcm). Кроме того, множественные маркеры CD дифференциально экспрессированы между стадиями созревания Т-клеток.
Наивные CD8 Т-клетки (CD45RA + CD27 +) почти все положительные в отношении изоформы CD45RA, CD31 (PECAM-1) и костимулирующих молекул CD27 и CD28. В то время как интегрины (CD18 и CD11c) экспрессированы во всех подмножествах Т-клеток, при этом степень их экспрессии увеличивается с созреванием. Относительное количество поверхностного CD45RA примерно в два раза выше, чем CD3, что, в свою очередь, было почти вдвое больше, чем CD27
CD гранулоцитов
Нейтрофилы - самая большая популяция лейкоцитов, составляющая 55,23 ± 3,12% всех CD45+ клеток. Эозинофилы составляют 3,45 ± 0,76%, а базофилы 0,26 ± 0,12% всех одиночных живых CD45+.
Между нейтрофилами и эозинофилами 20 молекул CD значительно различаются. К ним относятся хорошо описанные CD10, CD15 и CD16, а также интегрины CD11b, CD11c, CD18; интегрин-лиганд CD50; рецепторы комплемента CD35, CD88 и CD93; и рецептор IgA CD89.
Около половины значительно отличающихся маркеров между базофилами и эозинофилами находятся вблизи пограничной экспрессии (10 3). Из остальных 11 значительно выше у базофилов и включают тетраспанины CD9, CD53 и CD82; FcγRII (CD32); молекулы множественной клеточной адгезии (CD38, CD44, CD54, CD62L); фактор распада комплемента CD55; и член семьи SLAM CD84. И наоборот, эозинофилы экспрессируют значительно больше CD15, гликопротеинов CD22 и CD24, эктоэнзима CD39, рецептора TNF CD40 и молекул адгезии CD49f и CD66c.
СD моноцитов
Моноциты составляют 8,74 ± 0,65% всех одиночных живых CD45-положительных клеток. Из всех моноцитов 91,12 ± 0,93% составляют классические моноциты, за которыми следуют неклассические моноциты, 4,52 ± 0,63%, и промежуточные моноциты, 4,32 ± 0,58%.
Таким образом, три подмножества моноцитов: классические, промежуточные и неклассические можно определить на основе дифференциальной экспрессии CD14 и CD16 , причем, было показано, что эти подмножества связаны с различными заболеваниями .
Иммунофенотипирование моноцитов
Классические моноциты (CD14 ++ CD16 -) ∼ 90%
Промежуточные моноциты (CD14 ++ CD16 +) ∼ 4%
Неклассические моноциты (CD14 + CD16 ++ ) ∼ 6%
Неклассические моноциты характеризуются высокой экспрессией CD16 и низкой экспрессией CD14, в то время как промежуточные моноциты характеризуются высокой экспрессией CD14/CD16.
Поскольку фенотипирование не только моноцитов, но NK-клеток и дендритных клеток может включать CD16, можно представить коктейль для фенотипирования для всех трех типов клеток, который включает коктейль клонов вместе с антителами, специфичными для HLA-DR, CD11c, CD14, CD16, CD56 и CD123.
Моноцитарно – тромбоцитарные агрегаты (CD42b)
Экспрессию CD42b можно использовать для оценки моноцитарно-тромбоцитарных агрегатов. Адгезия тромбоцитов на всех моноцитах составляет 3,46 ± 0,46 %, на классических моноцитах — 2,86 ± 0,36 %, на промежуточных моноцитах — 5,98 ± 0,68 % и на неклассических моноцитах — 5,33 ± 1,05 % (Baumer Y., et.al., 2020).
Маркеры макрофагов (СD-68)
Пять антител, Y1/82A, Y2/131, EBM11, Ki-M6 и Ki-M7, в пределах миелоидной панели реагентов признаны маркерами большинства макрофагов тканей человека, присутствующих в срезах тканей. Эта группа антигенов обозначена как CD-68 на основании результатов работ K. Micklem et al. (1989). CD-68 считается селективным маркером моноцитов и макрофагов человека и обычно используется в исследованиях патологии.
Cпецифический CD-68 присутствует в различных тканевых макрофагах, включая клетки Купфера, макрофаги зародышевого центра, альвеолярные макрофаги и костные остеокласты. Как на уровне RNA, так и на уровне белка, CD-68 экспрессируется не только в макрофагах и моноцитах, но также экспрессируется немиелоидными типами клеток, такими как Т-клетки, фибробласты, эндотелиальные и опухолевые клетки.
Дендритные клетки
PBMC у здоровых людях состоят приблизительно из 70% T-клеток, 10% B-клеток, 10% моноцитов и 1% каждого из клеток натруальных киллеров (NK) и дендритных клеток (DC).
DC - это мощные APC с почти уникальной способностью праймировать нативные Т-лимфоциты. Из-за недостатка в крови DC обычно генерируются путем культивирования моноцитов e vivo с цитокинами.
Иммунорегуляторный индекс
(CD4+/CD8+ )
Соотношение CD4 + / CD8 + в периферической крови здоровых взрослых составляет около 2: 1, а измененное соотношение может указывать на заболевания, связанные с иммунодефицитом или аутоиммунитетом. Перевернутое соотношение CD4 + / CD8 + (а именно менее 1/1) указывает на ослабленную иммунную систему.
Иммунорегуляторный индекс (CD4 + / CD8 +)
Снижение
Мужской пол
Дефицит эстрогенов
Имммунодефицит (ослабленная иммунная система) врожденный (синдромы Ди – Джорджи, Незелофа, Вискотта – Олдрича) и приобретенный (ВИЧ, тяжелый комбинированный иммунодефицит ).
Бактериальные инфекции (туберкулез), диморфные грибы, токсоплазмоз, лейшманиоз
Вирусная инфекция (цитомегаловирусная инфекция)
Отсутствие ответа на вакцинацию против гепатита В и желтой лихорадки
Хронические процессы
Эндокринные заболевания
Стресс
Онкологические заболевания (множественная миелома, солидные опухоли с метастазами)
Воздействие радиации и токсических химических веществ
Ожирение и нарушение липидного обмена
Физиологическое иммуное старение и маркер утолщения интимы – медиа сонных артерий, жесткости артерий , скорости клубочковой фильтрации и саркопении
Риск возникновения диабета 1 типа у родственников первой линии родства
Повышенный риск смерти после инфаркта и реанимационных сердечно – легочных мероприятий
Депрессия
Лечение в солярии
Повышение
Женский пол
Прогрессирование патологических процессов (онкологических , инфекционных)
Подавление иммунного ответа на инфекцию, вакцинацию, рак
Аутоиммунные ( хронические ) и аллергические заболевания
Гематологические онкологические заболевания ( острый Т – лимфобластный лейкоз , хронический Т – лейкоз, тимома
Иммунные реакции ( «трансплантат против хозяина», отторжение трансплантанта)
Недостаток солнечного света и витамина D
Как эффекторные хелперные Т-клетки ( Th1 и Th2 ) , так и регуляторные Т – клетки (T reg ) имеют поверхностный маркер CD4, так что, хотя общее количество CD4 + Т-клеток уменьшается с возрастом, относительный процент CD4 + Т-клеток увеличивается. Увеличение T reg с возрастом приводит к подавлению иммунного ответа на инфекцию, вакцинацию и рак без подавления хронического воспаления, связанного со старением.
Снижение соотношения CD4 + / CD8 + связано со снижением устойчивости к инфекции. Ожирение и нарушение регуляции липидного обмена в печени приводит к потере CD4 +, но не CD8 + клеток, что способствует индукции рака печени.
Снижение соотношения CD4 + / CD8 + связано со старением и является показателем иммуносенесценции. По сравнению с CD4 + T-клетками, CD8 + T-клетки демонстрируют большее увеличение жировой ткани при ожирении и старении, тем самым снижая соотношение CD4 + / CD8 +. Увеличение количества клеток CD8 + необходимо для воспаления жировой ткани и инфильтрации макрофагов , тогда как количество клеток CD4 + уменьшается в этих условиях. Рекрутирование макрофагов клетками OCD8 + в жировую ткань может инициировать дальнейшее рекрутирования обоих типов клеток.
Несмотря на то, что некоторые, в основном зарубежные , авторы высказывают определенный скепсис в отношении значимости и возможностей правильной интерпретации иммунорегуляторного риска. Мы полагаем, что помимо ВИЧ – инфекции , где данный индекс без сомнения признан всеми важным диагностическим и прогностическим индикатором этот индекс тажке полезен для интерпретации и других заболеваний , например , вирусных инфекций и аллергических заболеваний. Так , например , исследователи обнаружили значительное увеличение субпопуляций активированных лимфоцитов ( СD4+ CD25, CD4 + CD69+ , CD4 – CD25 + , CD4- CD69+ ) в пищеводе экспериментальных животных зараженных аллергеном. Создается впечатление, что иммунорегуляторный индекс в целом выше у пациентов с прогрессированием заболевания ( например , некоторых онкологических или инфекционных заболевания ) , чем в группе пациентов без симптомов прогредиентности патологического процесса).
Относительный % CD4+ снижен, а %CD8+ у многих пациентов с врожденным или приобретенным иммунодефицитом, например, такими, как тяжелый комбинированный иммунодефицит и синдром приобретенного иммунодефицита.
Иммунологическое старение характеризуется низкой долей наивных CD8 + клеток и большим количеством CD8 + клеток памяти. Физические упражнения могут уменьшить или обратить вспять этот эффект, если они не выполняются с чрезмерной интенсивностью и продолжительностью.
ВИЧ – инфекция инфекция приводит к низким уровням CD4 + T-клеток (понижая соотношение CD4 + / CD8 +) через ряд механизмов, включая уничтожение инфицированных CD4 + T-клеток цитотоксическими лимфоцитами CD8, которые продуктивно инфицируют клетки. Когда количество CD4 + Т-клеток падает ниже критического уровня, клеточный иммунитет теряется и организм постепенно становится более восприимчивым к оппортунистическим инфекциям. У пациентов с туберкулезом наблюдается снижение соотношения CD4 + / CD8 +
Исследование соотношения CD4+/CD8+ (CD3, CD4, CD8, CD4/CD8) рекомендовано только для мониторинга ВИЧ-инфекции и контроля эффективности АРВ терапии. Это соотношение позволяет определить абсолютное и относительное количество Т-лимфоцитов, субпопуляций Т-хелперов, цитотоксические лимфоциты и их соотношение.
Снижение наблюдается при врожденных иммунодефицитах (синдром Ди-Джоржи, Незелофа, Вискотта-Олдрича), при вирусных и бактериальных инфекциях, хронических процессах, воздействии радиации и токсических химических веществ, множественной миеломе, стрессе, снижается с возрастом, при эндокринных заболеваниях, солидных опухолях.
CD4+/CD8+ является патогномичным признаком для HIV-инфекции (менее 0,7). Увеличение значения более 3 – отмечается при аутоиммунных заболеваниях, остром Т-лимфобластном лейкозе, тимоме, хроническом Т-лейкозе. Изменение соотношения может быть связано с количеством хелперов и цитотоксических лимфоцитов у данного пациента. Например, снижение количества CD4+ Т-клеток при острой пневмонии в начале заболевания ведет к снижению индекса, а цитотоксические лимфоциты при этом могут не измениться.
Для дополнительного исследования и выявления изменений иммунной системы при патологиях требующих оценки наличия острого или хронического воспалительного процесса и степени его активности, рекомендуется включать подсчет количества активированных Т-лимфоцитов с фенотипом CD3+HLA-DR+ и ТNK–клеток с фенотипом CD3+CD16++56+.
Менее половины CD4 + -клеток и менее четверти CD8 + Т-лимфоцитов в периферической крови остаются наивными.
Таким образом , соотношение CD4 / CD8 является отражением состояния иммунной системы. Нормальное соотношение составляет от 1 до 4. У людей без HIV-инфекции обычно больше клеток CD4, чем клеток CD8.
С возрастом защита иммунной системы от патогенов ослабевает, а соотношение CD4 / CD8 демонстрирует тенденцию к снижению.
У людей с аутоиммунными заболеваниями, как правило, повышенно соотношение CD4 / CD8, а с вирусными инфекциями - пониженно.
Субпопуляция натуральных киллеров с фенотипом CD3- CD56+
Молекула CD56 – адгезивная молекула, широко представленная в нервной ткани. Кроме натуральных киллеров, экспрессируется на многих типах клеток, в том число на Т-лимфоцитах.
Увеличение данного показателя свидетельствуют о расширении активности специфического клона клеток киллеров, которые имеют меньшую цитолитическую активность, чем NK-клетки с фенотипом CD3- CD16+. Количество этой популяции возрастает при гематологических опухолях (ЕК-клеточная или Т-клеточная лимфома, плазмоклеточная миелома, апластическая крупноклеточная лимфома), хронических заболеваниях, некоторых вирусных инфекциях.
Снижение отмечается при первичных иммунодефицитах, вирусных инфекциях, системных хронических заболеваниях, стрессе, лечении цитостатиками и кортикостероидами.
Рецептор CD95+ –
Рецептор CD95 + - один из рецепторов апоптоза - сложного биологического процесса, необходимого для удаления из организма поврежденных, старых и инфицированных клеток. Рецептор CD95 экспрессируется на всех клетках иммунной системы, играя важную роль в контроле функционирования иммунной системы,причем, его экспрессия на клетках определяет готовность клеток к апоптозу.
Снижение доли CD95+-лимфоцитов в крови пациентов свидетельствует о нарушении эффективности последнего этапа выбраковки дефектных и инфицированных собственных клеток, что может привести к рецидиву заболевания, хронификации патологического процесса, развитию аутоиммунных заболеваний и повышению вероятности опухолевой трансформации (к примеру, рака шейки матки при папилломотозной инфекции). Определение экспрессии CD95 имеет прогностическое значение при миело- и лимфопролифератиных заболеваниях.
Добавить отзыв