Аллопрегнанолон и нейровоспаление

         Стероиды, синтезируемые из предшественников в центральной или периферической нервной системе, привлекают значительное внимание многих исследователей в последние годы. Гематоэнцефалический барьер (BBB) ​​является проницаемым  для стероидов, вырабатываемых гонадой и надпочечниками, а точная нейроанатомическая сегрегация локально синтезированных стероидов, то есть нейростероидов, дает им явное преимущество перед периферическими стероидами с точки зрения оказания специфических для мозга эффектов в нервной системе. В дополнение к связыванию с внутриклеточными стероидными рецепторами некоторые нейростероиды взаимодействуют с рецепторами нейротрансмиттеров, таким образом влияя на биологию отдельных типов нервных клеток.

       Восстановление локально синтезированного или периферического производного прогестерона до дегидропрогестерона (DHP) и тетрагидропрогестерона (THP) является одним из широко изученных факторов пути синтеза нейростероидов. В то время как прогестерон и DHP могут связываться с внутриклеточными стероидными рецепторами, преобладающая форма THP, аллопрегнанолон, может взаимодействовать только с рецепторами GABA-A на клеточной поверхности и передавать по ним сигналы.

       Производное прогестерона аллопрегнанолон (АLLО) является одним из наиболее широко изученных соединений среди нейростероидов. Было показано, что посредством взаимодействия с рецепторами GABA-А, экспрессируемыми нейронами и глиальными клетками, ALLO влияет на различные аспекты физиологии нервных клеток, включая пролиферацию и выживание клеток, миграцию и экспрессию генов. Последние данные указывают на важную роль ALLO в различных нейродегенеративных заболеваниях, включая болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и рассеянный склероз (РС). О нарушении регуляции в путях биосинтеза ALLO сообщалось в ткани мозга пациентов с РС, а также в ткани центральной нервной системы (ЦНС), полученной на моделях животных с РС. Было показано, что введение аллопрегнанолона  уменьшает нейроповеденческий дефицит вместе с  воспалением в ЦНС животных с аутоиммунной демиелинизацией.

      Эти результаты согласуются с  сообщениями, указывающими на стимулирующее рост и дифференцировку действие ALLO на нейроны и глиальные клетки, а также на его нейропротекторное эффекты в контексте других заболеваний ЦНС. Эти результаты также повысили вероятность того, что ALLO может влиять на биологию лейкоцитов и связанные с ней нейровоспалительные механизмы независимо от его нейрорегенеративных свойств.

        Рассеянный склероз (РС) является сложным заболеванием ЦНС, имеющим как воспалительные, так и дегенеративные аспекты (Sospedra and Martin, 2005 ; Trapp and Nave, 2008 ). Симптоматика  РС характеризуется инфильтрацией лейкоцитов в ЦНС с последующим повреждением миелина, локальным глиозом и повреждением аксонов. Обычно считается, что патогенный процесс при рассеянном склерозе  инициируется нарушением иммунной толерантности к антигенам ЦНС вследствие генетических факторов или факторов окружающей среды, что приводит к активации и пролиферации нейроантиген-реактивных Т-клеток в периферической иммунной системе у восприимчивых к этому заболеванию людей. Активированные Т-клетки и макрофаги затем проникают в ЦНС и становятся реактивированными, что приводит к локальной активации микроглии и внутрипаренхиматозной  генерации хемокинов и воспалительных цитокинов. Последующие волны инфильтрации лимфоцитарных и моноцитарных клеток в ЦНС вызывают широкое нейровоспаление с последующим повреждением миелина и повреждением аксонов. Некоторые авторы  придают большее значение врожденным иммунным ответам  по сравнению с адаптивными иммунными процессами при нейровоспалении , возникающим при рассеянном склерозе. Альтернативное мнение считает, что начальные нейродегенеративные события, в том числе апоптоз олигодендроцитов или структурное изменение миелина, могут происходить на ранних стадиях заболевания, а затем запускать последующие воспалительные явления. Независимо от того, является ли инициирующее событие в процессе заболевания РС врожденной или адаптивной иммунной дисрегуляцией или феноменом нейродегенеративной / клеточной гибели, разрушение миелина и повреждение аксонов являются конечными звеньями патологического процесса , которые лежат в основе клинических симптомов заболевания.

         Локализованная и четко разграниченная природа патологии при РС заставляет задуматься о том, может ли очаговая дисрегуляция в микросреде ЦНС способствовать процессу заболевания в дополнение к инфильтрации миелин-реактивных Т-клеток и других лейкоцитов. Многочисленные исследования показали связь между рассеянным склерозом  и стероидными гормонами. 

         После открытия нейростероидов в ЦНС были предприняты попытки выяснить роль этих соединений и их потенциальную дисрегуляцию в контексте рассеянного склероза и нейровоспаления.

          Эффекты прогестерона и его производных в стимулировании образования миелина в периферической нервной системе были признаны в течение почти двух десятилетий (Baulieu and Schumacher, 1997). Было показано, что клетки Шванна экспрессируют функциональные рецепторы ГАМК-А и отвечают на лечение ALLO путем активации двух основных белков миелина, то есть белка миелина 22 и Р0 (Melcangi et al. , 1999). Позднее было сообщено, что прогестерон и аллопрегнанолон (ALLO)  индуцируют экспрессию гена миелинового основного белка (MBP) в органотипических культурах срезов мозга. Исследователями было также показано, что влияние прогестерона на экспрессию гена MBP в значительной степени опосредовано внутриклеточными рецепторами прогестерона, эффекты ALLO были опосредованы рецепторами ГАМК-А, экспрессируемыми на олигодендроцитах. В дополнение к стимулированию экспрессии гена белка миелина в зрелых олигодендроцитах было показано, что прогестерон усиливает пролиферацию предшественников олигодендроцитов в культурах среза мозжечка через рецепторы внутриклеточного прогестерона, но подобный эффект не был описан для ALLO. Тем не менее, было показано, что ALLO индуцирует пролиферацию нейропрогениторных клеток гиппокампа крыс или корковых нервных стволовых клеток человека, при этом полученные клетки демонстрируют нейрональный фенотип. Сообщается, что в дополнение к своим промиелинизирующим эффектам ALLO защищает олигодендроциты от цитотоксических стимулов. При обработке рекомбинантным TNF-α культивируемые олигодендроциты крысы проявляют пониженную жизнеспособность, что количественно определяется иммунореактивностью CNPase. Предварительная обработка ALLO (100 нМ) снижала токсичность TNF-α (Noorbakhsh et al.,2011 ). ALLO оказывает промиелинизирующее, а также цитопротективное действие на олигодендроциты против воспалительных стимулов, и оба эти эффекта актуальны из-за положительных результатов в контексте аутоиммунной демиелинизации.

         Известно, что макрофаги экспрессируют функциональные рецепторы ГАМК-А, и активация рецепторов приводит к снижению продукции воспалительных цитокинов этими клетками . Было показано, что лечение различными агонистами ГАМК-А изменяет поведение макрофагов и дендритных клеток и результирующий ответ Т-клеток после презентации антигена (Bhat et al., 2010 ). При лечении ALLO перитонеальные макрофаги мыши продуцируют более низкие уровни TNFα после стимуляции LPS. Лечение ALLO также снижало экспрессию макрофагов IDO, фермента, участвующего в различных воспалительных процессах
         Помимо инфильтрации моноцитов в ЦНС, активация микроглии, резидентных моноцитоидных клеток головного мозга, также играет важную роль во время нейровоспалительных процессов (Jack et al., 2005 ). Как и в случае макрофагов, было показано, что микроглия экспрессирует рецепторы как ГАМК-А, так и ГАМК-В, а лечение агонистом ГАМК-А мусцимолом снижает выработку микроглии медиаторов воспаления после стимуляции LPS. Тем не менее, исследования, изучающие влияние ALLO на функцию микроглии, ограничены.  Исследование Muller et al. показал снижение продукции NO стимулированными LPS клеточными линиями микроглии BV2 после обработки прогестероном или ALLO (Muller and Kerschbaum, 2006). Интересное исследование Mead et al.показал, что активация рецепторов ГАМК-А в микроглии может привести к усилению активности различных изоформ NADPH-оксидазы (Nox), фермента, ответственного за генерацию супероксид-ионов. В то время как активация Nox с помощью передачи сигналов глутамата приводит к нейротоксическому фенотипу, GABA-A-рецептор-опосредованная активация фермента способствует нейропротективному фенотипу (Mead et al., 2012 ). Остается выяснить, может ли ALLO-опосредованная активация рецепторов микроглии GABA-A способствовать дифференцировке клеток в направлении нейропротективного противовоспалительного фенотипа.

      Измененная активность антигенпрезентирующих клеток после воздействия ALLO или других агонистов рецептора GABA-A может привести к изменениям в пролиферации и дифференцировке лимфоцитов, однако, мало что известно о прямом воздействии ALLO на лимфоциты. Было показано, что человеческие и мышиные лимфоциты экспрессируют функциональные рецепторы ГАМК-А. Лечение агонистом ГАМК-А - мусцимолом ингибирует антиген-специфическую пролиферацию Т-клеток (Tian et al., 1999 ), а активация ГАМК-А приводит к цельноклеточным переходным и тоническим токам в Т-лимфоцитах. 

         Важным шагом в процессе аутоиммунного нейровоспаления является прохождение ВВВ периферически активированными лейкоцитами. Эти клетки включают нейроантиген-реактивные лимфоциты или моноциты, поступающие в ЦНС после градиента хемокинов, генерируемого локально активированной микроглией или ранее инфильтрированными лимфоцитами. Было показано, что как прогестерон, так и ALLO снижают дисфункцию BBB после фокальной ишемии. Этот эффект был частично приписан подавленной экспрессии MMP-2 и MMP-9 в ишемическом мозге после лечения ALLO. Более того, было показано, что ALLO предотвращает деградацию белков плотного соединения BBB, окклюдина 1 и клаудина 5 . Вероятно, что лечение ALLO может также повлиять на проницаемость BBB и трафик лейкоцитов во время аутоиммунного воспаления. 

        Роль прогестерона и его потенциальных производных в демиелинизирующих заболеваниях изучалась в течение многих лет (Shuster, 2008 ). До идентификации путей синтеза нейростероидов в головном мозге сообщалось, что лечение мышей с экспериментальным аутоиммунным энцефаломиелитом  прогестинами улучшало течение  заболевания (Arnason and Richman,1969). Более поздние исследования дополнительно подчеркнули защитную и противовоспалительную роль прогестерона при аутоиммунном энцефалите  (Garay et al., 2007 ). Было показано, что обработка прогестероном нейроантиген-реактивных CD4 + T-клеток, выделенных от пациентов с рассеянным склерозом, влияет на их выработку цитокинов. Прогестерон и его восстановленная форма дегидропрогестерон (DHP) могут связываться с внутриклеточными рецепторами прогестерона и оказывать геномные эффекты посредством измененной экспрессии генов, чувствительных к прогестерону. Однако у ALLO нет этой способности, и он может оказывать свое влияние только через взаимодействие с рецепторами ГАМК-А. Учитывая, что экзогенно вводимый прогестерон может быть легко восстановлен до ALLO в разных клетках, защитные эффекты, о которых сообщалось в отношении прогестерона, вероятно, были следствием как геномной регуляции, так и путей, опосредованных GABA-A-рецептором.

         Последующие исследования предоставили более конкретные доказательства, подтверждающие роль ALLO в патогенезе рассеянного склероза. В исследовании, проведенном на вскрытии ткани головного мозга человека,  группа авторов показала, что уровни ALLO были значительно снижены в белом веществе мозга, полученном от пациентов с РС, по сравнению с контрольными индивидуумами. Снижение было связано с уменьшением уровней двух важнейших вышеперечисленных ферментов, которые участвуют в превращении прогестерона в ALLO, то есть 5-α-редуктазы и AKR1C1 / C2, в белом веществе мозга пациентов с РС. Уровни дальнейшего восходящего фермента, 3-α-HSD, который участвует в превращении прегненолона в прогестерон, в мозге МС не изменялись. Интересно, что анализ уровней 3α, 5β-THP, минорной изоформы THP, не выявил каких-либо изменений в тех же тканях головного мозга, что указывает на специфическое подавление в 3α, 5α-ALLO изоформе. Подобный анализ тканей спинного мозга, полученных от мышей EAE, показал снижение уровней ALLO, но не изоформ минорной THP у мышей EAE по сравнению с контрольными животными.  Опять же, подавление ALLO было связано с пониженными уровнями РНК и белка мышиных изоформ ферментов AKR1, akr1c14 и akr1e1. 

           В литературе сообщалось также, что усиленный синтез эндогенного ALLO является защитным в контексте аутоиммунной демиелинизации. Транслокаторный белок (TSPO) представляет собой транспортный белок, расположенный в наружной мембране митохондрий, ранее названный периферическим бензодиазепиновым рецептором и признанным маркером для активированных глиальных клеток. Посредством взаимодействий со StAR (стероидогенным острым регуляторным белком) TSPO осуществляет ограничивающую скорость передачу холестерина в митохондрии, где он может превращаться в прегненолон. Было показано, что модуляция активности TSPO с помощью этифоксина - лиганда TSPO, может усиливать синтез нейростероидов в мозге. Лечение было эффективным, когда препарат вводился на предсимптомной стадии заболевания или на пике заболевания. Следует отметить, что TSPO демонстрирует повышенную регуляцию астроцитов и микроглии при различных нейровоспалительных расстройствах, которые могут быть частью эндогенно регулируемого защитного ответа в контексте нейровоспаления.

         Со времени открытия дисрегуляции ALLO при некоторых неврологических расстройствах, ALLO и его синтетические аналоги рассматривались на предмет их потенциальных терапевтических или модифицирующих заболевание эффектов при заболеваниях головного мозга.

         Интересно, что ганаксолон, синтетический аналог ALLO, был успешно использован для лечения эпилепсии у людей (Nohria and Giller,2007 ; Pieribone et al., 2007 ), а также недавние исследования нашей группы показывают, что ганаксолон также оказывает противовоспалительное действие при EAE (Paul et al., 2014 ). В настоящее время проводятся клинические испытания для оценки терапевтических эффектов ALLO при ЧМТ , в то время как также ожидаются клинические испытания ALLO для лечения умеренных когнитивных нарушений и болезни Альцгеймера (Irwin and Brinton, 2014 ). В целом, учитывая богатство знаний, полученных в результате анализов in vitro и in vivo , наряду с низкой токсичностью и хорошей переносимостью у людей, ALLO и его аналоги являются отличными кандидатами, ожидающими тестирования на рассеянном склерозе  и другими нейровоспалительными заболеваниями.