Диагностическое тестирование на вирусы проводится либо для документирования предшествующей инфекции, либо для помощи в диагностике острого заболевания. При идеализированной вирусной инфекции, репликация вируса, клинические симптомы, появление иммуноглобулинов M (IgM) и антител IgG, элиминация вируса и разрешение заболевания происходят в предсказуемой прогрессии. Когда заболевание является следствием репликации вируса и лизиса клетки-хозяина, диагностические усилия должны быть сосредоточены на обнаружении вируса, а образцы должны быть собраны как можно раньше при заболевании, когда титры вируса максимальны. С другой стороны, некоторые патологические процессы опосредованы реакцией хозяина на вирусные инфекции, и ключевым моментом является обнаружение антител. Вирусы, связанные с иммуноопосредованными заболеваниями, включают вирус Эпштейна-Барра (EBV), вирус гепатита B (HBV) и парвовирус B19. К сожалению, существуют важные отклонения от сценария острой инфекции, прогрессирующей до элиминации вируса, такие как персистенция вируса, латентность, реактивация и позднее заболевание.
Вирусы нуждаются в живых клетках для репликации. В ранних работах в области вирусологии использовались приматы, яйца с эмбрионами, мыши-сосуны и другие восприимчивые животные-хозяева. Признание того, что вирусы могут размножаться в культивируемых клетках человека и животных, привело к Нобелевской премии Эндерса, Веллера и Роббинса (Enders, Weller, and Robbins) , а выделение в клеточной культуре стало золотым стандартом диагностики вирусов. Для культивирования широкого спектра клинически значимых вирусов необходимо множество различных клеточных линий . В клинической лаборатории используются три основные категории клеточных линий: первичные, диплоидные и непрерывные или гетероплоидные. Большинство лабораторий, выполняющих обычные вирусные культуры, инокулируют клинический образец в две или три разные клеточные линии в зависимости от искомых вирусов . Культуры инкубируют и наблюдают в течение 1–3 недель на предмет появления характерных вирусных цитопатических эффектов. Время до обнаружения этих эффектов в обычной культуре определяется инокулятом вируса, характером роста конкретного вируса, инокулированной клеточной линией (линиями), ротацией культуры, температурой инкубации и частотой исследований. К сожалению, идентификация вирусов с помощью обычной культуры может занять несколько недель из-за медленного роста некоторых вирусов и малого количества инокулята.
Когда при дифференциальной диагностике рассматривается ограниченное число специфических вирусов, можно использовать более целенаправленный подход, такой как экспресс-культура с использованием пробирок со скорлупой.
Флаконы-снаряды, названные так из-за их сходства с патронами для дробовика, представляют собой небольшие флаконы, в основании которых находится покровное стекло, покрытое клеточным монослоем. После инокуляции образца флаконы центрифугируют для повышения чувствительности, что приводит к синониму культур быстрого центрифугирования. В заранее установленные моменты времени после инокуляции покровные стекла снимают с флаконов-оболочек, а монослои клеток фиксируют ацетоном и подвергают окрашиванию IF моноклональными антителами (MAb) к специфическим вирусам.
Серология
Наличие антител указывает на воздействие вируса в прошлом, получение вакцины, перекрестную реакцию на близкородственный вирус или даже на пассивный перенос антител, если были введены продукты крови или иммуноглобулины. Антитела IgM вырабатываются сразу после инфицирования и являются преходящими; таким образом, наличие антивирусного IgM считается синонимом текущей или недавней инфекции. Сероконверсия от отрицательного к положительному IgG в соответствующий период времени является самым убедительным доказательством недавней вирусной инфекции. В надлежащем клиническом контексте четырехкратное повышение титра сывороточных антител также считается диагностическим; однако лишь немногие клинические лаборатории все еще проводят определение титров антител (т. е. серийное разведение образца сыворотки и тестирование каждого разведения для определения конечного титра). Антитела IgG с низкой авидностью указывают на недавнюю инфекцию; таким образом, тест на авидность использовался во время беременности, чтобы оценить, отражают ли цитомегаловирус (СMV) и IgG краснухи недавнюю первичную инфекцию.
Спинномозговая жидкость (CSF) может быть проверена на интратекальное образование противовирусных антител в качестве маркера инфекции центральной нервной системы (CNS). Для арбовирусов обнаружение антител IgM в спинномозговой жидкости предпочтительнее, чем молекулярные тесты на вирусную нуклеиновую кислоту, хотя для максимальной чувствительности необходимо использование обоих тестов. Для выявления вирусспецифических IgG в CSF требуются образцы, собранные позже в ходе инфекции, чем для IgM, и исключение пассивного переноса IgG из крови в CSF. Молекулы IgG легче диффундируют через гематоэнцефалический барьер, а их присутствие в спинномозговой жидкости может просто отражать высокий уровень антител в сыворотке крови. Таким образом, парные образцы CSF и сыворотки должны быть проверены на антитела к подозреваемому патогену, а также к контрольному вирусному патогену. Несмотря на то, что в прошлом для диагностики герепесного -энцефалита обычно использовали , в большинстве случаев тестирование СSF на противовирусные IgG было заменено тестированием на IgM или ПЦР (PCR)
Еще одним крупным достижением стало использование инструментов произвольного доступа, обычно используемых в химических лабораториях, для серологии инфекционных заболеваний. Для традиционных серологических анализов на основе микропланшетов образцы тестируются партиями на планшете и проходят как единое целое через этапы добавления реагентов, инкубации, промывки и обнаружения, чтобы снизить затраты и повысить эффективность. Одна партия должна быть завершена, что требует 3–4 часов, прежде чем следующую партию можно будет загрузить в прибор. Образцы могут стоять в очереди на несколько дней, пока не будет доступно достаточно большое количество образцов для тестирования. Платформы с произвольным доступом, напротив, позволяют непрерывно загружать и тестировать образцы, протестированные на различные аналиты, что значительно сокращает время обработки. Методы случайного доступа или «по запросу» часто используют хемилюминесцентные метки, которые излучают свет при возбуждении химической энергией.
Анализы на антитела IgM
Ложноположительные и ложноотрицательные результаты являются серьезной проблемой при тестировании на вирусспецифические IgM. Высокий уровень IgG может блокировать связывание IgM с вирусным антигеном на твердой фазе, что приводит к ложноотрицательным результатам. Сыворотки, содержащие ревматоидный фактор (антитело IgM с анти-IgG-специфичностью), часто дают ложноположительные результаты. Были разработаны методы удаления мешающих IgG и ревматоидного фактора из сыворотки перед тестированием / Альтернативой предварительной обработке сыворотки является анализ захвата класса IgM, также называемый обратным захватом или μ-захватом.
ПЦР
В ПЦР используются небольшие праймеры ДНК (примерно 20 пар оснований (п.н.)), которые связываются с комплементарными областями последовательности нуклеиновой кислоты-мишени. Температура, при которой праймеры ДНК отжигаются с целевой последовательностью ДНК, зависит от длины праймеров и целевой последовательности и в большинстве случаев составляет около 55–60 ° C. ПЦР использует термостабильную ДНК-полимеразу, первоначально выделенную из Thermus aquaticus.(Taq), бактерии, обитающая в горячих источниках, оптимальная активность которой составляет около 72 °C. Однако Taq-полимераза относительно стабильна при более высокой температуре (примерно 95 °C), необходимой для «расплавления» более крупных цепей двухцепочечной ДНК (дцДНК), полученных с помощью ПЦР, в одноцепочечные. Термостабильность Taq-полимеразы позволяет проводить несколько циклов амплификации, состоящих из повышения температуры до 95°C для расплавления двухцепочечной ДНК, снижения температуры до 55°C для отжига праймеров и повышения температуры до 72°C для полимеразной активности. Когда это повторяется в течение 30–45 циклов, ДНК-мишень удваивается с каждым циклом, и происходит экспоненциальное расширение исходной последовательности нуклеиновой кислоты, что облегчает ее обнаружение. Поскольку ДНК является матрицей для ПЦР-амплификации, перед ПЦР необходимо использовать обратную транскриптазу (ОТ) для синтеза комплементарного сегмента ДНК (кДНК) из матрицы РНК, например, для РНК-вирусов. Когда ПЦР выполняется на кДНК, полученной с помощью ОТ, это называется ОТ-ПЦР; это не следует путать с ПЦР в реальном времени.
Методы ПЦР в реальном времени сократили время проведения анализов и остаточную контаминацию, упростили количественный анализ и позволили быстро внедрить анализы в лаборатории, способные проводить анализы в домашних условиях. Несмотря на многочисленные преимущества молекулярных методов, важно помнить, что бывают как ложноположительные, так и ложноотрицательные результаты. Из-за своей высокой чувствительности ПЦР чувствителен к контаминации амплифицированной ДНК или перекрестной контаминации положительными клиническими образцами. Кроме того, латентные вирусы могут реактивироваться бессимптомно и вводить в заблуждение клиницистов.
Добавить комментарий