Немедленные реакции гиперчувствительности к лекарственным средствам (DHRs) напоминают типичные симптомы, опосредованные иммуноглобулином E (IgE). Клинические проявления варьируют от местных кожных реакций, желудочно-кишечных и/или респираторных симптомов до тяжелых системных поражений с потенциальным летальным исходом. В зависимости от группы веществ вызывающего лекарство постановка правильного диагноза представляет собой серьезную проблему. Кожные пробы и in vitroдиагностика часто ненадежна и не воспроизводима. Во многих случаях участие специфичных к лекарственным средствам IgE сомнительно. Вещество-виновник (исходное лекарство или метаболит) и потенциальные перекрестно реагирующие соединения трудно идентифицировать, история болезни пациента и лекарственные провокационные тесты часто остаются единственными средствами для диагностики. Следовательно, несколько групп предложили тест активации базофилов (BAT) для диагностики немедленных DHR, поскольку базофилы являются хорошо известными эффекторными клетками при аллергических реакциях. Тем не менее, полезность BAT для немедленного DHR сильно варьирует и зависит от самого препарата и его способности спонтанно конъюгировать с белками сыворотки. Стимуляция чистыми растворами исходного лекарственного средства или его метаболитов по сравнению с конъюгатами лекарственное средство-белок может повлиять на чувствительность и специфичность теста.
Ключевой характеристикой аллергических эффекторных клеток при аллергии немедленного типа является аллерген-специфический IgE, связанный с высокоаффинным рецептором IgE, т.е. FcεRI, на клеточной поверхности. Захват аллергенов поверхностным IgE приводит к перекрестному связыванию FcεRI и вызывает острую фазу аллергического ответа, включающую внезапное высвобождение вазоактивных медиаторов в ткани и/или кровоток. Этот внезапный процесс активации и высвобождение медиатора называется анафилактической дегрануляцией и может вызвать опасную для жизни анафилаксию . Тучные клетки и базофилы обладают этими ключевыми характеристиками. Тучные клетки находятся в ткани и считаются первичными эффекторными клетками аллергии. Базофилы представляют собой гранулоциты периферической крови, легко доступные через вену и хорошо зарекомендовавшие себя заменители для диагностики аллергии.
Активацию базофилов можно измерить с помощью проточной цитометрии и многоцветного окрашивания флуоресцентно-мечеными детектирующими антителами, нацеленными на специфические маркеры идентификации и активации на поверхности базофилов. Наиболее распространенные стратегии идентификации используют поверхностный IgE, хемокиновый рецептор 3 эотаксина CC (CCR3), комбинацию рецептора интерлейкина 3 с альфа-цепью CD123 high с человеческим лейкоцитарным антигеном HLA-DR neg , комбинацию рецептора простагландина D 2 CRTH-2 high с CD3 . neg или базофилспецифичной эктонуклеазы CD203c.
Для активации базофилов определяют маркер дегрануляции, ассоциированный с лизосомами мембранный гликопротеин-3 (LAMP-3), также называемый CD63, или активацию CD203c. Таким образом, изменения в состоянии активации могут быть количественно оценены на основе одной клетки. Дегрануляция означает слияние специфических внутриклеточных везикул, наполненных заранее сформированными медиаторами, так называемых гранул, с плазматической мембраной и переход CD63 изнутри наружу. Результатом является внезапное и выраженное повышение, т.е. логарифмический сдвиг сигнала интенсивности флуоресценции при обнаружении поверхностного CD63. Одновременно, наблюдалась активация CD203c, которая может быть обнаружена как значительное увеличение среднего сигнала интенсивности флуоресценции детектирующего антитела CD203c. В дополнение к анафилактической дегрануляции был описан другой тип активации базофилов, называемый частичной дегрануляцией. Этот альтернативный механизм активации может также приводить к измененной поверхностной экспрессии маркеров активации, которую можно оценить с помощью BAT . Следовательно, BAT был признан многообещающим инструментом для диагностики in vitro аллергии или других реакций гиперчувствительности, включая немедленные побочные реакции на различные лекарства (Hoffmann et al.).
Обычно BАТ проводят из цельной крови, обработанной гепарином, цитратом или ЭДТА-антикоагулянтом, взятой у доноров с аллергией/гиперчувствительностью . При использовании ЭДТА в качестве антикоагулянта необходимо добавлять Са ++ , чтобы обеспечить надлежащую дегрануляцию. Для стимуляции базофилов in vitro образцы инкубируют только с аллергеном/лекарством или буфером (отрицательный контроль) в течение от нескольких минут до часов при 37°С. В качестве положительного контроля используют анти-IgE-антитела, анти-FcεRI-антитела и формил-метионин-лейцин-фенилаланин (fMLF). Последний представляет собой альтернативный стимул дегрануляции/активации и важен для демонстрации функциональности базофилов в случае доноров, базофилы которых не реагируют in vitro на стимуляцию IgE-опосредованного пути, так называемых нереспондеров.
Добавить комментарий