Лабораторная диагностика шизофрении

     По мнению многих психиатров  в нашей стране более миллиона человек страдают от "шизофрении" - психического  расстройства с непонятным симптоматическим и эпидемиологическим профилем. Биомаркеры шизофрении могут потенциально революционизировать ее терапию, в частности, психофармакологию этого психического расстройства.

    Исследования геномики намекают на то, что лица , предрасположенные к шизофрении подвержены к определенным хромосомным локусам и генам. 

    Современные протеомные инструменты, особенно масс-спектрометрия и сканирование экспрессии, направлены на выявление как патогенетических  так и диагностически значимых биомаркеров нейропсихиатрических расстройств. Одна из таких протеомных утилит позволяет обнаруживать белки и методы профилирования биологических отпечатков  (SELDI-TOF-MS), а затем подвергает их тандемной масс-спектрометрической фрагментации и de novo секвенирование белка (MALDI-TOF / TOF-MS) для точной идентификации и характеристики белков. Такие утилиты могут объяснить патогенез нейропсихиатрического расстройства, предоставить более объективные методы его тестирования и дополнительно продемонстрировать биологическую основу заболевания.

     Протеомические исследования в медицине были в основном сфокусированы на диагностике рака и неинвазивном мониторинге, в основном с помощью образцов сыворотки. Многие из них выявили потенциальные биомаркеры или биохимические молекулы, которые идентифицируют определенное болезненное состояние и могут быть обнаружены или измерены. Например, опухолевый маркер CA125 (MUC16) предоставляет полезную информацию об устойчивости к болезням, реакции на лечение и даже раннем выявлении при  рака яичников.

     В идеале диагностический маркер должен соответствовать нескольким условиям: 1) он обнаруживает фундаментальную особенность заболевания с высокой чувствительностью и специфичностью; 2) подтверждается в случаях после смерти ; 3) стандартизирован с помощью надежной биоинформатики; 4) специфичен для конкретного заболевания по сравнению с сопутствующими расстройствами; 5) надежный во многих средах тестирования / лабораториях; 6) неинвазивный; 7) прост в исполнении; и 8) недорогой.

     В этой заметке  описывается способность протеомных подходов точно идентифицировать новые биомаркеры, которые могут дать представление о патогенезе шизофрении. Кроме того, протеомные исследования могут привести к открытию диагностических и прогностических биомаркеров и потенциальных новых молекулярных мишеней для разработки лекарств.

Генетика

     Ранние исследования генетического компонента шизофрении использовали исследования сцепления в качестве основного анализа. В родословных исследованиях было рассчитано местоположение многих ДНК-маркеров, сравнено в когортах больных и людей без болезней, и была вычислена вероятность статистической значимости (то есть, балла LOD), подтверждающая или опровергающая связь.  Мета - анализ нескольких исследований сцепления позволил предположить корреляцию с некоторыми хромосомными областями; однако ни один из них не приблизился к приемлемому общегеномному значению. В то время как они успешно картировали гены для моногенных или менделевских расстройств, исследования сцепления недостаточны для сложных многофакторных расстройств, таких как шизофрения.

    В более поздних работах использовались ассоциативные исследования, в которых сравнивали частоты аллелей при шизофрении и контрольных группах. По сути, она тестировалась на неравновесное сцепление, когда два аллеля или генетических маркера редко разделяются с помощью кроссовера. Чтобы свести к минимуму этническую дисперсию по частоте аллелей, были проведены исследования семейных ассоциаций, где по крайней мере один участник был поражен шизофренией. Они показали смешанные результаты; тем не менее, центральные области, где чаще всего присутствовали генетические аберрации, а именно дофаминовые, серотониновые и NMDA-рецепторы, показали слабую связь с шизофренией или не имели ее вообще. 

   Генетические исследования выявили множество локусов восприимчивости, а также большие хромосомные аберрации при шизофрении. Однако появление высокопроизводительного профилирования микрочипов позволило быстро и экономно оценить тысячи уровней экспрессии генов. Префронтальная кора головного мозга, в частности, область Бродмана 9 (BA 9), была идентифицирована как видное место дисфункции при шизофрении, основанная на исследованиях нейровизуализации, клинических и посмертных заболеваниях, и стала центром исследований микрочипов. Исследования также выявили недостаточную экспрессию пресинаптических маркеров , основных метаболических путей , а также генов развития и созревания олигодендроцитов.

   В то же время,  данные по экспрессии генов не всегда коррелируют с экспрессией белков и не могут идентифицировать посттранскрипционные и посттрансляционные модификации, основные модуляторы функции белка и предположительно патогенез нейропсихиатрического расстройства. Кроме того, большинство исследований микрочипов шизофрении были основаны на посмертных тканях мозга, то есть клинически недоступной среде.

Протеомика

     В «постгеномную» эпоху прогрессия исследований направлена ​​на анализ основных эффекторов физиологических функций - белков. Основные геномные проекты последнего десятилетия сформировали протеомное секвенирование, картирование и анализ. Например, создание Проекта протеома мозга человека,  Организации протеома человека для содействия эффективному международному обмену протеомными данными мозга.

   В отличие от генома, протеом состоит из активного набора молекул, которые постоянно модифицируются и имеют особую локализацию. Протеомные подходы способны характеризовать посттрансляционные модификации - метод, с помощью которого клетка динамически и быстро модифицирует функцию белка и регулирует как образование, так и деградацию в ответ на клеточные возмущения (например, провокация болезни). Методы профилирования и идентификации белка с использованием масс-спектрометрии и биоинформатики могут привести к открытию, идентификации и характеристике белковых биомаркеров, дифференциально выраженных в нейропсихиатрических расстройствах.

    Подобно профилированию экспрессии гена мРНК, в последнее десятилетие появилось несколько методов профилирования белка, которые не требовали априорного знания генов или белков-кандидатов. От вариаций гель-электрофореза до появления пептид-специфической масс-спектрометрии, каждая методика предоставляет свой метод дифференциального анализа экспрессии белка.  Профилирование протеомов пораженных и здоровых тканей позволяет обнаружить молекулярные изменения пептида или белка, что потенциально позволяет получить информацию о патогенезе или диагностике болезни.

   Первоначальные протеомные исследования основывались на 2D-GE, который разделяет белки на основе двух факторов: изоэлектрической точки и молекулярной массы. Процесс сложный, обременительный и, конечно, не надежный. Он никогда не предназначался для того, чтобы служить волшебником открытия биомаркеров; скорее его использование было ограничено открытием патогенов. Edgar et al. (1999)  применили этот подход к протеому гиппокампа шизофрении и контрольных групп для выявления 108 дифференциально экспрессируемых белков. Наиболее  недостаточно экспрессируемый белок в "шизофреническом гиппокампе" подвергался расщеплению пептидов и секвенированию N-концевых пептидов. Основываясь на простом поиске в базе данных белков, авторы показали, что белок является ингибитором связывания диазепама (DBI). Отчеты показывают, что DBI может связываться с GABA A (сайт распознавания)  и, следовательно, подавляет действие гамма-аминомасляной кислоты (GABA), ингибирующей нейромедиаторной системы, измененной при шизофрении. Далее авторы идентифицировали три дифференциально экспрессируемых белка при шизофрении: марганцевая супероксиддисмутаза (MnSOD) была недостаточно экспрессирована; и белок-медиатор коллапсирующего ответа 2 (CRMP-2) и t-комплексный белок 1 (TCP-1) были сверхэкспрессированы. MnSOD катализирует дисмутацию супероксидного аниона (O 2 - ) в воду (H 2 O) и перекись водорода (H 2 O 2 ). В нервной ткани она может защищать выживание клеточных мембран. CRMP-2 регулирует рост аксонов и полярность , а его сверхэкспрессия может объяснить взаимосвязи нейронов в мозге больного шизофренией.  TCP-1 представляет собой белок-шаперон, который способствует правильной укладке и расположению белка . Он обладает защитными свойствами в мозге, предотвращая вызванные стрессом апоптотические пути в нейронах. Отметим, что 2D-GE анализ плода с синдромом Дауна выявил значительное снижение TCP-1 во втором триместре беременности , что может объяснить раннюю патологию данного нейропсихиатрического расстройства. Авторы предположили возможное изменение оборота цитоскелета при шизофрении. Возможно, механизм цитологической аберрации заключается в посттрансляционной модификации - окислении / нитровании.

    Окислительный стресс особенно выражен при нейродегенеративных заболеваниях, таких как болезнь Альцгеймера и болезнь Паркинсона. Исследования экспрессии генов с шизофренией последовательно идентифицировали транскрипты, связанные с окислением. Теории постулировали, что, когда производство вредных окислителей превышает уровень антиоксидантных соединений, макромолекулы, такие как ДНК и белки, становятся мишенью окислительной атаки, которая сигнализирует о последующей смерти клеток. Более того, японские ученые первыми выявили белки-мишени для нитрования в мозге крыс, в состав которых входил TCP-1 . Оригинальная методология исследования не позволяла проводить тестирование посттрансляционных модификаций; поэтому состояние TCP-1 в шизофренической ткани гиппокампа остается неизвестным.

    Расположение хромосом - еще одна особенность исследования, которая проливает свет на шизофрению. Три из четырех охарактеризованных белков были картированы в хромосомном плече 6q. Их близость обнаруживает область, важную при шизофрении, и подтверждает восприимчивость локусов, обнаруженных в исследовании сцепления.

    Область протеомики значительно расширилась с появлением масс-спектрометрического анализа пептидов. Масс-спектрометрия состоит из четырех компонентов. Во-первых, источник ионов генерирует ионизированные пептиды или белки из образца. Во-вторых, масс-анализатор сортирует и разделяет белки на основе их отношения масса / заряд ( m / z ). В-третьих, ионный детектор обнаруживает ионы и собирает данные об ионах m / z , количестве и времени полета (TOF) или времени, которое потребовалось для достижения детектора. Наконец, биоинформационный анализ интерпретирует необработанные данные в значимые результаты (например, дифференциальное профилирование белка).

     Матричная лазерная десорбционная ионозация ( MALDI) считается стандартом инструментов MS. Специальная химическая матрица наносится на образец и позволяет конденсироваться. После того, как лазеры активируют матрицу, энергия передается пептидам или белкам, и они направляются по прямой траектории к детектору в газовой фазе. Это помогает в двух видах анализа: создание пиковой модели или сигнатуры, характерной для данного заболевания, и идентификация по логическому выводу. В последнем случае белковый комплекс обычно протеолитически переваривается перед ионизацией, создавая специфические пептидные расщепления. После запуска МС и в процессе, называемом «отпечаток пальцевой массы», массы пептидов, полученные из отношения m / z , запрашиваются в нескольких базах данных (например, MS-fit UCSF и Aldente ExPASy) для определения идентификации белка.

      Китайские исследователи  использовали технологию MALDI для анализа спинномозговой жидкости и обнаружили значительное подавление аполипопротеина A-IV (апо AIV). Однако, учитывая недостаток опубликованных работ, связывающих ЦНС и этот аполипопротеин, они не смогли интерпретировать свои находки. Апо AIV представляет собой гликопротеин, секретируемый кишечником , который сигнализирует о насыщении организма после потребления липидов. У крыс мРНК и белок апо AIV были обнаружены в гипоталамусе, и их концентрации коррелировали с состоянием питания. Недостаточная экспрессия апо AIV при шизофрении свидетельствует о корреляции между повышенным риском увеличения веса и резистентностью к инсулину, обусловленной либо заболеванием, либо побочным эффектом антипсихотических средств.

    Отбор образцов спинномозговой жидкости представляет собой серьезную проблему. Некоторые высокоэкспрессируемые белки, в частности сывороточный альбумин, трансферин и иммуноглобулины, часто маскируют белки с низким содержанием. Исследователи из Novartis в Швейцарии определили оптимизированный протокол для подготовки образцов и анализа SELDI для исследований CSF.

     Как и при любом спектрометрическом анализе, образцы должны быть обработаны в некоторой части перед ионизацией. Технология SELDI, разновидность MALDI, основана на массивах ProteinChip. Каждый чип предлагает уникальную хроматографическую поверхность для селективного захвата белка. Например, IMAC ProteinChip включает иммобилизованный металл, часто медь, в качестве своего средства для захвата сродства. CM10 ProteinChip - это матрица со слабым катионом, а Q10 - это матрица с сильным анионным обменом.

    Ни в одном опубликованном исследовании шизофрении еще не использовались профилирующие и секвенирующие свойства тандемного масс-спектрометрического анализа. Тем не менее, несколько исследований продемонстрировали потенциал этой технологии в определении сложности динамического протеома.  Анализ последовательности может обнаружить посттрансляционные модификации, такие как ацетилирование, триметилирование, фосфорилирование, сульфатирование и N- или O-гликозилирование. Он предлагает сложную информацию, такую ​​как убиквитилирование, которая может выявить сайты для репарации, регуляции транскрипции и апоптоза.

      При шизофрении отмечается снижение экспрессии гена и белка Reelin (RELN) и активация молекулы адгезии нервных клеток (NCAM).  Исследователи подтвердили снижение экспрессии мРНК RELN в шизофренических интерстициальных нейронах белого вещества в гиппокампальной формации и дорсолатеральной префронтальной коре. Точно так же NCAM сверхэкспрессируется в гиппокампе и префронтальной коре. RELN является секреторной протеазой, продуцируемой GABAergic интернейронами, и связывается с пирамидными нейронами или GABAergic интернейронами, активно экспрессирующими продукт гена-1 (DAB-1). Большинство сигнальных путей RELN опосредуются через DAB-1, включая миграцию нейронов, синаптическую пластичность, передачу и выживание. NCAM представляет собой поверхностный белок, структурно сходный с иммуноглобулином и фибронектином. Он вовлечен в гомофильное связывание для клеточной адгезии и тех же процессов, что и RELN. Эти два гликопротеина являются отличными мишенями для определения характеристик МС / МС. Используя аффинную очистку для двух молекул, образцы могут быть обработаны для идентификации белкового комплекса с использованием масс-спектрометрии. Партнеры по связыванию белка также могут быть идентифицированы как часть комплекса при нацеливании на известные домены сигнальной трансдукции (например, SH2 и Grb2).

     Протеомика обладает способностью значительно влиять на обнаружение лекарств при шизофрении тремя основными способами. Во-первых, методы профилирования и идентификации белка могут идентифицировать новые фармацевтические мишени и совместно регулируемые соединения. Во-вторых, протеомика может измерять текущие реакции на лекарства.

Категория сообщения в блог: 

Добавить отзыв