Механизмы нейровирусных инфекций

Роль лимфоцитов в вирусной нейроинфекции

   Используя модель вирусного энцефалита (мышиный цитомегаловирус, MCMV), исследователи  показали, что постэнцефалитный мозг поддерживается в воспаленном  состоянии,проявляющим себя в  реактивности глиальных клеток, сохранении проникающей в мозг тканевой резидентной памяти CD8 +Т-клеток и длительной персистенции антителопродуцирующих клеток В-линии. 

     Нейровоспаление происходит одновременно с накоплением и сохранением иммуносупрессивных регуляторных Т-клеток (Tregs), и усугубляется после их абляции. Однако степень, в которой эти Tregs функционируют для контроля нейроиммунной активации после энцефалита MCMV, неизвестна.  Авторы одного исследования использовали трансгенных мышей Foxp3-рецептор дифтерийного токсина-GFP (Foxp3-DTR-GFP), которые после введения низких доз дифтерийного токсина (DTx) приводят к специфическому истощению Tregs, чтобы исследовать их функцию. Исследователи  обнаружили, что лечение DTx во время острой фазы вирусной инфекции головного мозга (0-4 dpi) приводило к истощению Tregs из мозга, обострению энцефалита (то есть увеличению присутствия CD4 +).и CD8 + T-клетки) и появлению хронических реактивных фенотипов резидентных глиальных клеток (т.е. повышенный уровень MHC класса II, а также уровни PD-L1, устойчивый микроглиоз и повышенная экспрессия глиального фибриллярного кислого белка (GFAP) на астроцитах) по сравнению с необработанным зараженные животные. 

   Эта хроническая провоспалительная среда  связана со снижением когнитивных способностей в задачах пространственного обучения и памяти (Barnes Maze) у выздоравливающих животных.  Хроническая активация глиальных клеток, неослабное пост-энцефалитное нейровоспаление и связанные с ним долгосрочные неврологические последствия в ответ на вирусную инфекцию головного мозга модулируются иммунорегуляторными свойствами Tregs. 

   Даже после "очистки" от обнаруживаемого вирусного антигена и устранения острого воспаления мозг не сразу возвращается в состояние, предшествующее инфекции, а скорее сохраняется в течение длительного периода в хроническом провоспалительном состоянии. Экспериментальные исследования показали, что с использованием хорошо известных экспериментальных моделей заражения головного мозга вирусом простого герпеса (HSV) -1 и мышиным цитомегаловирусом (MCMV) , микроглия, идентифицированная как CD45 int CD11b +клетки, находящиеся в мозге, не приобретают реактивные фенотипы исключительно для врожденных ответов на сами вирусные белки. 

     После инфицирования головного мозга подавляющее большинство микроглии проявляют хроническую реактивность даже в областях, удаленных от вирусной репликации. Скорее глиальные клетки, находящиеся в мозге, реагируют на адаптивные иммунные ответы и медиаторы, продуцируемые инфильтрирующими мозг Т-клетками, включая интерферон (IFN) -γ.  . 

    В дополнение к вирусной инфекции, длительная активация резидентной микроглии, наряду с устойчивым присутствием резидентных Т-клеток памяти мозга, была продемонстрирована при широком разнообразии нейродегенеративных заболеваний и инсультов центральной нервной системы (CNS)  ( Burda , Sophroniew , 2014). 

     Правильно регулируемые нейроиммунные реакции на инфекцию должны обеспечивать баланс между клиренсом патогена и приемлемым уровнем повреждения ткани. Длительные иммунные ответы в головном мозге после MCMV-инфекции характеризуются персистентностью антителопродуцирующих В-клеток, хронической активацией микроглиальных клеток и сохранением специфичных для вируса CD8 + Т-клеток эффекторной памяти ( Mutnal et.al., 2011 ; Mutnal et.al., 2012) .   Несмотря на то, что СD8 + T-клетки играют критическую роль в контроле распространения вируса во время острой мозговой инфекции ( Cheeran et.al., 2005; Reddehase et.al., 1987), хроническое присутствие этих IFN-γ-продуцирующих лимфоцитов может повредить мозг.  В дополнение к благоприятным противовирусным эффектам включения провоспалительных нейроиммунных реакций подавление воспаления также имеет решающее значение для ограничения повреждения тканей и сохранения неврологической функции.

   Исследователи показали, что как микроглиальные клетки, так и астроциты обладают способностью подавлять постэнцефалитные CD8 + Т-лимфоциты посредством активации лиганда для запрограммированного рецептора смерти (PD) -1 (то есть запрограммированного лиганда смерти 1, PD-L1). , B7-H1, CD274) (  Schachtele et al. 2014). 

    Дополнительные исследования показали, что противовоспалительные регуляторные B-клетки, продуцирующие интерлейкин (IL) -10 (B10), которые модулируют клетки микроглии, а также T-лимфоциты, обнаруживаются в постэнцефалитном мозге(Mutnal et.al., 2014) ( цитотоксический CD8 + ).   Было показано, что Т-клетки ответственны за разрушение здоровых "нейронов-наблюдателей" ( McPherson et al. 2006). Хотя поддержание повышенной иммунной готовности после вирусной инфекции может способствовать защите и привести к более быстрому очищению от патогенных микроорганизмов после повторного воздействия или реактивации, ясно, что эти хронические реакции также должны быть хорошо отрегулированы. 

    Хорошо известно, что CD4 + регуляторные T-клетки (Tregs) поддерживают порядок во время аутоиммунных и воспалительных реакций, а также иммунных ответов, генерируемых во время вирусной инфекции ( Lanteri et.al., 2009; Suvas et.al., 2004; Trandem et.al., 2010). Кроме того, Tregs необходимы для минимизации повреждения ткани в ответ на вирусную инфекцию ( Veiga - Parga et.al., 2013), а дисбаланс или дисфункция, вызванная истощением популяции Treg во время вирусной инфекции, приводит к формированию патологической ткани. Кроме того, истощение Treg, как было продемонстрировано, превращает нелетальный энцефалит в заболевание высокой смертности, не влияя на клиренс вируса ( Anghelina et.al., 2009). Присутствие этих клеток было зарегистрировано в головном мозге после вирусного энцефалита, где их продукция трансформирующего фактора роста (TGF) -β может поддерживать поддержание ЦНС-резидентных Т-клеток памяти CD8 + посредством увеличения экспрессии CD103 ( Graham et.al., 2014). Недавно в инфицированном мозге были обнаружены специфичные для вируса гепатита мыши (MHV) Treg Foxp3 + CD4 +, и было показано, что они уменьшают вирусный энцефалит путем подавления эффекторных функций Т-клеток во время как примирования в дренирующих лимфатических узлах, так и эффекторных стадиq. Эти патоген-специфические Tregs также продемонстрировали уменьшение активации клеток микроглии во время острой инфекции, о чем свидетельствует снижение экспрессии главного комплекса гистосовместимости (MHC) класса II через 7 дней после заражения (dpi) ( Zhao et.al., 2014). Тем не менее, полная степень взаимодействия Tregs с резидентными клетками головного мозга для модуляции вирусного энцефалита остается неизвестной. Представляет интерес исследование вклада популяции Treg-лимфоцитов в контроль реактивного глиоза, наряду с постэнцефалитным нейровоспалением и долгосрочными неврологическими последствиями, в отдаленные моменты времени после заражения.

   Клетки Foxp3 + Treg накапливаются в мозге мышей после инфицирования нейротропными вирусами.  Накопление этих иммуносупрессивных клеток в головном мозге происходит одновременно с хроническим нейровоспалением, наблюдаемым после заражения головного мозга MCMV . Кроме того, сообщалось, что клиническое заболевание во время вирусной инфекции является более тяжелым после истощения популяции Treg. Истощение популяции Treg из энцефалитного мозга не только приводит к заметному увеличению числа T-клеток, но и продлевает хронические реактивные фенотипы (сами резидентские глиальные клетки). 

   Лечение мышей Foxp3-DTR-GFP DTx (0-4 dpi), как было обнаружено, явно истощает клетки Treg из мозга, различие между группами лечения было наиболее значительным на ранних стадиях инфекции (7 dpi). Использование этих трансгенных животных является стандартным подходом для изучения эффектов Treg in vivo., но это приводит к резкому, полному истощению этой важной регуляторной популяции клеток, что может быть ограничением модели. Числа Treg в головном мозге быстро восстановились и не изменились заметно на 14 dpi, что, вероятно, представляет собой попытку иммунной системы восстановить надлежащий гомеостатический контроль. Как это ни парадоксально, ранее сообщалось, что фактическое количество клеток Treg часто повышается в тканях-мишенях во время аутоиммунных и воспалительных заболеваний, но неспособность этих проникающих в ткани Tregs модулировать заболевание предполагает, что они могут быть функционально скомпрометированы, даже если они присутствуют в повышенных количествах. Хотя количество клеток Treg в головном мозге восстановливается на 14 dpi, неспособность подавить хроническую реактивность глиальных клеток предполагает, что клетки, которые переполняют мозг, были функционально скомпрометированы. Недавно были получены аналогичные результаты с использованием острого истощения DTx Tregs в экспериментальной мышиной модели энцефалита вируса Западного Нила (WNV), где числа Treg в инфицированном мозге вернулись к постоянным значениям на 20 dpi, но при этом развивалась долговременная резидентная память Ответы Т-клеток были нарушены. Хотя возможен функциональный компромисс Tregs, который восстанавливается после острой абляции, также возможно, что воспалительная среда инфицированной ЦНС может сделать эффекторные T-клетки и глиальные клетки устойчивыми к Treg-опосредованной супрессии, несмотря на восстановление количества клеток. Другим возможным объяснением может быть просто временная задержка между эффектами Treg и возвращением проникающих Т-клеток в мозг, что, в свою очередь, может привести к усилению микроглиоза и астроцитоза.

   CD8 + эффекторные Т-клетки необходимы для вирусного клиренса после инфекции мозга MCMV. Таким образом, возможно, что потеря Treg-опосредованной негативной регуляции антивирусных ответов CD8 + лимфоцитов, происходящая после истощения Treg, может повлиять на возникновение вирусной инфекции. Тем не менее, данные исследования показывают, что MCMV-инфекция все еще была обнаружена  ​​в мозге животных, получавших лечение DTx, при оценке в 4 dpi. Аналогичное отсутствие влияния истощения Treg на вирусное распределение и клиренс было зарегистрировано в моделях инфекции головного мозга MHV и WNV . Взятые вместе, эти результаты позволяют предположить, что повышенная долговременная реактивность глиальных клеток, наблюдаемая после истощения Treg, была не просто обусловлена ​​измененной вирусной инфекцией.

   Хотя Tregs лучше всего известны своей способностью ограничивать иммунные ответыи предотвращать аутоиммунитет, все большее число исследований продемонстрировало, что вирусная инфекция способствует развитию патоген-специфических клеток Treg . Сообщалось, что перенос больших Tregs вместе с эффекторными T-клетками приводит к менее тяжелому клиническому заболеванию у MAG-инфицированных RAG - / - животных, но было обнаружено, что специфичные для патогенов Tregs являются еще более мощными. подавляющими, чем массовые Tregs . Поскольку в большинстве  исследованиях не изучали специфичность антигенов Treg и не определяли анатомическое место их развития, исследователи предпочитают использовать термин Treg для обозначения популяции Foxp3 + CD4 + T-клеток с подавляющей активностью, а не использовать  более конкретные термины tTreg или iTreg клетки ( Abbas et.al., 2013) . Сообщалось также, что у людей, но не у мышей, Foxp3 экспрессируется в CD4 +  T-клетках, которые, как было установлено, являются гипореактивными, но не обязательно супрессивными . Эти результаты предполагают, что между мышами и людьми могут быть важные различия в отношении Foxp3 в качестве маркера для Tregs. 

    После истощения Treg наблюдалась повышенная, длительная реактивность микроглиальных клеток и микроглиоз. В мозге, инфицированном вирусом, можно обнаружить две разные популяции мононуклеарных фагоцитов CD45 + (CD45 hi и CD45 int ) ( Seswick et.al., 1991) . 

    Во время инфекции MCMV исследователи продемонстрировали, что инфильтрирующая в мозг популяция CD45 hi макрофагов присутствует в ЦНС в ранние сроки (3 дня), но не позднее (30 дней) после заражения . Недавно было показано, что удаление клеток Treg связано со снижением количества альтернативно активированных макрофагов в месте травматического повреждения ( Walsh et.al., 2014). Однако в модели MCMV-инфекции мозга инфильтрирующие мозг макрофаги полностью отсутствуют при 30 dpi. Резидентные клетки микроглии (т.е. популяция CD45 int ) происходят от предшественников желточного мешка, которые "высевают" мозг на ранних стадиях развития и представляют клеточную популяцию, которая генетически отличается от макрофагов, происходящих из костного мозга (т.е. CD45 hi ) ( Ginhoux et.al., 2010 , Kierdorf et.al., 2013) . Только эти клетки CD45 int могут быть обнаружены в мозге фиктивных, имитируемых или неинфицированных животных. В одном  исследовании авторы  специально изучили популяцию клеток микроглии CD45 int CD11b hi для оценки различных маркеров клеточной активации.

   В литературе сообщалось, что микроглия, находящася в покое  (т.е. клетки CD45 int CD11b hi ) из неинфицированного мышиного мозга экспрессирует очень низкие конститутивные уровни МНС класса II (<5%). Однако после герпесвирусной инфекции мозга (с использованием HSV-1 или MCMV) экспрессия МНС класса II резко повышается на уровень  > 90% этих клеток. Эти данные демонстрируют пользу экспрессии MHC II в качестве суррогатного маркера реактивности микроглиальных клеток в ответ на провоспалительные состояния. Аналогично, низкий базальный уровень экспрессии PD-L1 также наблюдается примерно у 20% микроглии от неинфицированных мышей, но индуцированная экспрессия обнаруживается у более чем 90% клеток в течение одной недели после заражения ( Magnus et.al., Schachtele et.al., 2014). Как и MHC II, эти данные демонстрируют пользу от  экспрессии PD-L1 в качестве суррогатного маркера активации. Здесь абляция Treg-клеток увеличивает  уровень длительной реактивности микроглиальных клеток в ответ на инфекцию, что определяется по экспрессии  этих суррогатных маркеров активации. Кроме того, окрашивание Iba-1 микроглии в инфицированных тканях головного мозга продемонстрировало большее количество клеток с реактивным фенотипом после истощения Tregs. Подобные исследования  показывают, что резидентные микроглиальные клетки мозга пролиферируют во время острой фазы вирусной инфекции . В то время как эта пролиферация быстро возвращается к исходному уровню у животных с достаточным количеством Treg, устойчивый реактивный микроглиоз наблюдался у истощенных по Treg мышей.

     Астроциты - первые глиальные клетки, на которых было показано, что MHC II индуцибелен ( Lipp et.al., 2007). По сравнению с микроглией экспрессия на астроцитах развивается медленнее и менее устойчива, что делает их «непрофессиональными» антигенпрезентирующими клетками ( Vardjian et.al., 2012) . 

    Несмотря на то, что практически  мало исследований посвящено взаимодействию между Tregs и астроцитами, эксперименты in vitro показали, что первичные астроциты мыши поляризуют T-клетки CD4 + в Tregs, а также в подтипы Th1 (  Beurel et.al., 2014). Подобно микроглии, астроциты также приобретают реактивные фенотипы в ответ на провоспалительную среду. Этот фенотип обычно визуализируется с помощью иммуноокрашивания для GFAP и количественно определяется путем оценки уровня его экспрессии. Исследователи  оценили уровни экспрессии мРНК GFAP с использованием ОТ-ПЦР в реальном времени, а также уровень белка с помощью ИФА, и обнаружили, что он был значительно выше у животных с абляцией Treg по сравнению с мышами с достаточным количеством Treg. Это указывают на то, что инфильтрирующие в мозг клетки Treg также оказывают подавляющее влияние на реактивность астроцитов, астроглиоз и последующее глиальное повреждение.

     Переход от нормальной противовоспалительной микросреды мозга к более провоспалительному состоянию происходит при многих заболеваниях ЦНС. Модель MCMV-инфекции мозга приводит к хроническому нейровоспалению, которое сохраняется после вирусного клиренса, и в отсутствие обнаруживаемого вирусного антигена.

    Секреция IFN-γ инфильтрирующими мозг Т-клетками ответственна за долгосрочную активацию микроглии и продукцию фактора некроза опухоли (TNF) -α . Было также показано, что IFN-γ индуцирует микроглиальную экспрессию костимулирующих молекул Т-клеток (CD80 и CD86), которые являются необходимыми вторыми сигналами для глии для функциональной активации Т-клеток ( Aloisi , 2001).  Кроме того, синергетическое действие между TNF-α и IFN-γ в головном мозге усиливает вызванную оксидом азота нейродегенерацию ( Blais , Rivest , 2004) , подчеркивая важность минимизации хронического нейровоспаления. Хорошо известно, что Tregs модулируют активные формы кислорода, продуцируемые микроглиальными клетками, и, соответственно, подавляют вызванную микроглией нейротоксичность ( Reinolds et.al., 2009; Zhao et.al., 2012 ). Таким образом, усиление провоспалительной микросреды мозга, наблюдаемое после истощения Tregs во время острой вирусной инфекции, связано с повреждением нейронов, в частности, проявляющим себя  при оценке экспрессии MAP-2 как суррогатного маркера нейротоксичности. Хотя точные механизмы, с помощью которых Tregs подавляют воспаление, еще предстоит выяснить, хорошо известно, что эти клетки продуцируют высокие уровни IL-10 ( McGeachy , Anderton , 2005; Rubtsov et.al., 2008)  , который, как известно, регулирует нейровоспаления. Если не проводить тщательного лечения, это длительное воспаление мозга может привести к вторичному повреждению нейронов и, как следствие, к нейрокогнитивной дисфункции.

    Сверхактивная, постоянная иммунная активация может быть вредна для нейронов, что приводит к очаговой патологии и, соответственно, "поведенческому дефициту" ( Armien et.al., 2010). 

    Реактивные клетки микроглии связаны с синаптической дисфункцией, которая, как было показано, влияют на обучение и память ( Morris et.al., 2013)  . Дефицит памяти, вызванный пикорнавирусом, коррелирует с уровнем повреждения гиппокампа после экспериментального энцефалита (  Buenz et.al., 2006). Кроме того, иммунорегуляторные свойства клеток Treg, которые распознают антигены ЦНС, также связаны с нейрогенезом, обучением и памятью у животных с иммунодефицитом ( Kipnis et.al.; Ziv et.al., 2006).  Вызванный инфекцией MCMV  продолжительный  неврологический дефицит пространственного обучения и памяти после истощения Treg связан с хроническим реактивным глиозом. Таким образом,  нарушения нервной, когнитивной и поведенческой функций обычно наблюдаются у пациентов, выздоравливающих после вызванного инфекцией нейровоспаления.  

  Повышенные уровни энцефалитных Т-лимфоцитов присутствуют после регуляторного истощения Т-клеток во время острой вирусной инфекции мозга. Хроническая реактивность микроглиальных клеток и астроцитов наблюдается после регуляторной абляции Т-клеток. Непрекращающееся нейровоспаление после регуляционного истощения Т-клеток связано со снижением когнитивных функций (  Lokensgard J., et.al., 2015). 

   Лимфический индекс значительно увеличен при вирусных инфекциях и лишь незначительно при острых бактериальных инфекциях. Используя значение отсечения лимфатического индекса ≥ 12,92, можно достигнуть  чувствительности 91,67% и специфичности 97,2% для диагностики вирусной инфекции.