Появление геномики, протеомики, метаболомики, пептидомики, липидомики, гликомики и всех других «омиков» предоставляет огромное количество информации, которая обогащает наши знания о биологических системах.
Для решения биологических проблем нейропсихиатрических расстройств с использованием нейропротеомики необходимо применять несколько методов. Такие методы, как 2D-DIGE, масс-спектрометрия (MS), визуализация тканей на основе MS, белковые массивы, поверхностный плазменный резонанс (SPR), анализ сети взаимодействия белков, многомерная жидкостная хроматография и многие другие в настоящее время могут использоваться для этой цели.
Терминология
Для того, чтобы определить термин "нейропротеомика", мы должны начать с понимания термина протеомика. Существует много определений протеомики, например , касающихся изучения протеома , причем последний представляет собой полный набор белков органа или организма в данное время и при определенных физиологических условиях. Протеом является сложным и относится не только к идентификации белков в наборе. В любом данном протеоме белки могут взаимодействовать с определенным количеством других белков (или других молекул), показывая , как белок функционирует как часть всей системы. Кроме того, структура и / или функция белка могут быть изменены в результате изменений в окружающей среде, включая такие факторы, как температура, ионная сила, pH, уровень окислителей или антиоксидантов. Изучение протеома должно предоставить информацию обо всех этих факторах. Протеомика может начинаться с выяснения «протеома» в определенное время, но она также должна определять «динамику» этого протеома при всех возможных факторах, влияющих на орган или организм. Таким образом, протеомика по своей природе сталкивается с огромной задачей, которая требует сотрудничества множества дисциплин, включая физику, химию, биологию и биоинформатику.
Нейропротеомика является подразделом протеомики, предназначенным для ответа на те же вопросы об органах, тканях и клетках, которые составляют нервную систему. В нейропротеомике нашей целью является (i) идентификация всех белков данной ткани, типа клеток или органелл при определенных условиях в определенное время; (ii) выявление посттрансляционных модификаций всех белков в это время и в этих условиях; (iii) определение, как этот протеом изменяется в зависимости от времени (возраста), изменений окружающей среды, генетических факторов и заболевания; и (iv)определение, как эти изменения влияют на организм в целом.
В настоящее время, с существующими технологиями, современными знаниями о структуре и функциях белка, знаниями о всех возможных взаимодействиях белок-белок и белок-другие молекулы и доступными финансовыми ресурсами, полное достижение всех этих целей не является возможным. мы можем лишь найти «частичный набор» белков из данной ткани или определить, как подмножество этих белков изменяется под воздействием некоторых внешних факторов, таких, например, как определенный препарат и т. д. Фактически, полное определение протеома как представленное выше еще не было определено ни для одного органа или любой ткани - даже для отдельной клетки. Это то, что делает протеомику такой интересной областью - несмотря на столь многое, что было достигнуто, мы понимаем, что многое еще предстоит сделать.
В нейропротеомике различные части нервной системы «фрагментированы», чтобы лучше понять динамику каждого данного субпротеома. Нейропротеомика работает над решением протеома отдельных нейронов или астроцитов, выращенных в клеточных культурах или из первичных клеток головного мозга, выделенных из тканей при нескольких условиях; при выявлении набора белков, характеризующих опухоль головного мозга; или при определении набора белков, составляющих постсинаптические или пресинаптические плотности и т.д. Также исследователи часто пытаются решить специфический субпротеом, такой как протеом ответа теплового шока или протеом, реагирующий на окислительный стресс. Из этих примеров видно, что определенные группы белков выделяются для анализа таким образом, что в конечном итоге приводит к исследованию одного протеома и, возможно, к определению динамики этого протеома. Конечная цель будет состоять в том, чтобы предсказать, «как» будет развиваться протеом, когда на него влияют конкретные условия, и использовать эту информацию для разработки методов, которые будут модулировать эволюцию протеома.
Масс - спектрометрия
Масс-спектрометрия (МS) является "рабочей лошадкой" протеомики. Этот метод обладает огромной эффективностью с точки зрения чувствительности для обнаружения расщепленных пептидов или интактных белков. Современные разработки позволяют нацеливаться на конкретные модификации белков, такие как фосфорилирование, окисление, убиквитинирование и другие , хотя и обладающие различной степенью сложности. В отличие от других подходов, таких как дифракция рентгеновских лучей, которые требуют интактных белков либо в кристаллической форме, либо в растворе, соответственно, масс -спектрометрия требует, чтобы пептиды или белки исследовались как ионы в газовой фазе. Лазерная десорбция / ионизация с помощью матрицы (MALDI) и электрораспылительная ионизация (ESI) являются наиболее распространенными методами ионизации белков и пептидов, используемыми в протеомике на основе MS. Наличие контрольно-измерительных приборов и компьютерных программ, а также наличие баз данных о белках, которые можно использовать для автоматического сравнения с экспериментально полученными данными МS и МS / МS (секвенирование в газовой фазе), делает этот метод ведущим для идентификации и характеристики белка. В принципе, в одном образце могут быть идентифицированы от сотен до тысяч белков с помощью разделения методом жидкостной хроматографии (ЖХ) в сочетании с этими методами ионизации (LC-MALDI и / или LC / MS / MS).Основными препятствиями, с которыми мы сталкиваемся при применении МS для нейропротеомики, являются ограничения в доступности образцов.
Недавним применением МS для исследований нейропротеомики является молекулярная визуализация тканей головного мозга с помощью MALDI. Этот подход все еще находится в зачаточном состоянии и его приложения для нейропротеомика будет в основном для функционального анализа подмножеств белков и для понимания возникновения и прогрессирования неврологических заболеваний. Большим преимуществом визуализации тканей на основе MALDI является возможность создания трехмерных молекулярных изображений мозга или областей мозга, а затем использование этих изображений для определения динамической эволюции субпротеомов.
Масс-спектрометрия также широко используется для характеристики посттрансляционных модификаций белка . Попытка обнаружить фосфорилирование белка , убиквитинирование , пальмитоилирование , окисление и другие посттрансляционные модификации и определение их роли в нейрофизиологических процессах - это сложный аспект нейропротеомики.
Двухмерный гель-электрофорез
Двухмерный гель-электрофорез на основе акриламида является методом, который представляет собой огромный ресурс для исследований протеомики. Электрофорез в двумерном полиакриламидном геле (2D-PAGE) позволяет разделять от сотен до тысяч белков в одном эксперименте . Отделенные белки могут быть идентифицированы масс-спектрометрией, а некоторые потенциальные модификации могут быть проанализированы «в» геле. Например, некоторые фосфорилированные белки могут быть идентифицированы путем окрашивания фосфо-специфическими пятнами ) или фосфо-Ser / Thr-специфическими антителами; окисленные белки могут быть идентифицированы с помощью вестерн-блоттинга. 2D-PAGE - чрезвычайно полезный метод, который предлагает существенные преимущества для быстрого и точного разделения и анализа белка, а также предоставляет чрезвычайно полезный способ «визуализации» сложного образца. Как 1D-, так и 2D-PAGE могут быть объединены с разделением гелевых экстрактов на основе LC / MS («geLC»), чтобы обеспечить дополнительное измерение разделения для сложных смесей.
Протеомика с дифференциальным отображением (сравнительная протеомика) может применяться с использованием многомерной жидкостной хроматографии или электрофореза на основе 2D-геля. Протеомика с дифференциальным дисплеем очень мощная, поскольку дает преимущество сравнения нескольких образцов в одном эксперименте. Образцы для сравнения могут включать контрольную (нормальную) и экспериментальную (болезнь) выборку. Экспериментальный образец выбирается таким образом, чтобы он отражал влияние определенного состояния, включая влияние возраста, лекарства, гена, pH, окислительного стресса, тепла и т. д. Наиболее распространенный подход для дифференциального отображения - это гель-электрофорез в 2D-разнице . Этот метод позволяет сравнивать тысячи флуоресцентно меченных белков в одном эксперименте. С помощью этого метода можно определить изменения в экспрессии белка, а также возможные посттрансляционные модификации. Кроме того, различные типы флуорофоров могут быть использованы для исследования специфических свойств белка. Они могут включать модификации цистеина, тирозина, лизина и гистидина и практически любую модификацию, для которой может быть найден конкретный флуорофор. 2D-DIGE может использоваться для изучения посттрансляционных модификаций, включая убиквитинирование, фосфорилирование, окисление и пальмитоилирование, среди других модификаций. Как и с любым другим методом, 2D-DIGE имеет ограничения и преимущества, и в протеомных лабораториях обычно понимают, что одного метода недостаточно для ответа на все возможные вопросы о конкретном протеоме. Белки, выделенные и проанализированные с помощью 2D-DIGE, могут быть идентифицированы и охарактеризованы с помощью МS или объединены с иммуноблоттингом для анализа специфических субпротеом.
Жидкостная хроматография
Жидкостная хроматография ( LC) предлагает технологию разделения белков в жидкой фаз. Достижения во всех технических аспектах, связанных с LC , делают этот метод хорошим дополнением для любой лаборатории протеомики. Белки, выделенные с помощью LC, могут быть идентифицированы и охарактеризованы с помощью MS, или они могут быть использованы на 1D- или 2D-PAGE геля для дальнейшего сравнения. В нейропротеомике основной проблемой для LC или LC / MS является недостаточное количество образцов для анализа. Поэтому большие колонки с большими объемами не рекомендуется; вместо этого, наноразмерные разделения, микрожидкостные устройства и аффинная хроматография со специфическими антителами или другими молекулами для обогащения молекул-мишеней могут быть предпочтительными методами . LC может сочетаться с протеомикой дифференциального дисплея или распространяться на многомерные подходы для обеспечения более широкого спектра приложений протеомики.
Вестерн - блоты
Вестерн-блоты (WBs) представляют собой уникальный подход, который позволяет идентифицировать отдельные белки с использованием целевых антител против специфических белков. Широко используемый в биологических исследованиях, WB позволяет характеризовать дискретные изменения в экспрессии белка, а в сочетании с 2D-гелями также позволяет обнаруживать изменения в изоформах белка или посттрансляционных модификациях. Использование мультиплексированных WB с использованием предварительно меченных флуоресцентных антител позволяет количественно охарактеризовать множественные изменения белка в одном эксперименте. Несколько факторов ограничивают применение иммуноблоттинга для протеомики. К ним относятся низкая специфичность многих антител и отсутствие доступности чистых антител. Более того, антитела просто не существуют для некоторых белков. В настоящее время реализуется проект по протеомным антителам, который обеспечит ценный инструмент для исследований нейропротеомики.
Аналитическое ультрацентрифугирование
Аналитическое ультрацентрифугирование (AUC) предлагает быстрый и надежный метод определения молекулярного веса белка, его гидродинамических и термодинамических свойств. AUC основан на термодинамическом анализе седиментационного равновесия и может использоваться для определения чистоты образца, целостности структуры и степени агрегации. Этот метод может быть использован для изучения малых молекул (несколько сотен дальтон молекулярной массы, таких как небольшие пептиды) для многомиллионных сборок, таких как вирусы или многокомплексные белки, и органелл . AUC может быть применен к небольшим образцам в небольших объемах, что обычно встречается в исследованиях нейропротеомики. Седиментационное равновесие может быть использовано для определения молекулярных масс белковых комплексов в том виде, в котором они существуют в растворе, включая определение состояний агрегации, а также для изучения межбелковых взаимодействий и белковых взаимодействий с малыми молекулами.
Поверхностный плазмонный резонанс
Поверхностный плазмонный резонанс (SPR) является мощным методом для определения межбелковых взаимодействий в растворе . Этот метод предлагает определять константы ассоциации (Ka) и диссоциации (Kd) между двумя лигандами . Комбинация SPR и масс-спектрометрии позволяет идентифицировать сети взаимодействия белков, поскольку с помощью МS можно идентифицировать белки, связанные с лигандом или группой лигандов. Этот метод предлагает точные количественные параметры, которые не могут быть определены с помощью только белковых массивов.
Спектроскопия кругового дихроизма
Спектроскопия кругового дихроизма (CD) предлагает преимущество, заключающееся в обеспечении быстрого и надежного скрининга вторичных и третичных конформаций белка в растворе. Многие белки, ассоциированные с неврологическими заболеваниями, в том числе амилоидные β-пептиды, α-синуклеин и прионные белки, например, образуют олигомерные конформации, которые могут быть связаны с началом и прогрессированием некоторых заболеваний . CD является надежным методом для определения свернутых конформаций этих белков. Реализация CD с высокой пропускной способностью предоставит метод для классификации этих белков. На данный момент нейропротеомика должна использовать CD на дискретных образцах.
Перспективы
В настоящее время хорошим началом старта нейропротеомики будет возможность связать экспрессию белка и его модификацию с электрофизиологическими данными и с некоторыми из высших функций мозга. Среди множества проблем, с которыми мы сталкиваемся каждый день и которые необходимо решать «заранее», чтобы сбор данных мог быть успешным, является подготовка образцов. Общее присутствие небелковых компонентов, таких как нуклеиновые кислоты, липиды, углеводы и другие биомолекулы, может повлиять на результат анализа протеомики. Многие из этих «загрязнителей» на самом деле могут быть частью функционального протеома. Некоторые из этих биомолекул могут быть частью модуляторных механизмов ферментативных реакций, включая ДНК-, РНК-, липид-, гликолипид- и углевод-белковые взаимодействия. Таким образом, выяснение того, что является загрязняющим веществом и что является частью модуляторных механизмов в клетке или органелле, является проблемой, которую необходимо решить.
Область нейропротеомики требует намного больше работы и большой самоотдачи, чтобы раскрыть сети взаимодействия белков (PIN) . В настоящее время PIN-коды оцениваются с использованием данных геномики или с использованием отдельных групп белков. Тем не менее, общее представление о PIN-кодах, связанных с функциями нормального и больного мозга, все еще недоступно.
Основным толчком развития нейропротеомики стала мечта о том, чтобы найти биомаркеры на основе белков для нейродегенеративных заболеваний. Сегодня у нас есть сотни истинных белковых биомаркеров. Мы знаем много об отдельных белках, но все аспекты, касающиеся протеома , еще не известны даже для одного протеома, и мы знаем еще меньше о динамике протеом.
Добавить комментарий