Генерация вирусных векторов, таких как аденоассоциированный вирус (AAV) и лентивирус, которые способны к стабильной трансдукции нейронов, предлагает перспективную стратегию введения новых генов в мозг, что приводит к длительному производству специфических белков. Альтернативный подход к достижению трансгенной экспрессии в мозге - это "привитые клетки", которые генетически модифицированы с целью продуцирования нейроактивных веществ. Нейроактивные пептиды, аденозин и γ-аминомасляная кислота являются агентами, которые могут быть доставлены геном и клеточной терапией с потенциальной польхой и использоваться в терапии эпилепсии.
Вирусные векторы в сочетании с другими методами передачи гена in vivo являются новыми инструментами для изучения функции генов в центральной нервной системе млекопитающих (ЦНС). Более того, такие подходы генного трансфера могут вызывать экспрессию «терапевтических» молекул, обеспечивая потенциальные возможности для лечения некоторых заболеваний ЦНС.
Нейротропные вирусные векторы могут экспрессировать одиночные или множественные чужеродные гены, а также широкий спектр регуляторных элементов и могут быть сконструированы на любом или обоих уровнях капсида и промотора, чтобы обеспечить высококонтрастный, специфичный для клеток перенос генов. Нейротропные вирусные векторы также позволяют проводить кратковременную или долгосрочную трансгенную экспрессию ЦНС в различных областях мозга посредством стереотаксической доставки.
Для генной терапии были разработаны различные вирусные векторы, включая вирус простого герпеса, аденовирусы и ретровирусы. Адено-ассоциированная вирусная система (AAV), по-видимому, имеет ряд преимуществ для переноса генов по другим вирусным векторам, включая высокую эффективность инфекции и минимальную индукцию иммунных и воспалительных реакций хозяина.
Эффективность системы AAV основана на ее способности упаковывать любую ДНК до предела размера ~ 4,5 кб . ААВ-векторы непатогенны, поскольку им не хватает механизмов для репликации вируса, и, следовательно, инфекция будет ограничена участком инъекции. AAV очень беспорядочны и инфицируют практически все типы клеток во многих организмах-хозяевах; поэтому для ограничения экспрессии генов конкретным типам клеток необходимо использовать тканеспецифический (т. е. клеточный специфический) промотор.
Опасные эффекты рекомбинации , такие , как инсерционный мутагенез или реверсия к дикому типу , представляют собой общую проблему , которая может возникать с вирусными векторами , особенно , когда патогенные вирусы модифиируются для переноса генов.
Из-за делеции белка инициатора инициации репликации (Rep) рекомбинантный AAV (rAAV), как полагают, существует в основном в эписомальной форме с переменными уровнями интеграции в неразделенных клетках. Неспецифические эффекты хозяина на активность вируса, такие как промотирование промотора или иммунологические реакции, являются еще одной проблемой, связанной с использованием вирусных векторов. Интегрированные rAAV не сообщают о каких-либо мутагенных или вредных эффектах; однако высокая доза доставки может быть опухолегенной, что требует дальнейших долгосрочных исследований.
Дисбаланс в возбуждающей и тормозной нейротрансмиссии является широко признанной гипотезой о гипервозбудимости ЦНС, лежащей в основе эпилептического состояния. Поскольку доставка вируса через гены может привести к стабильной трансдукции нейронов с агентами, которые могут влиять на этот дисбаланс, приступы судорог представляют собой привлекательную мишень для генной терапии.
До сих пор терапевтические стратегии были сосредоточены на модуляции сигнализации, опосредуемой основными классическими возбуждающими и ингибирующими нейротрансмиттерами, глутаматом и γ-аминомасляной кислотой (ГАМК). Однако за прошедший 20-летний период все большее внимание уделяется группе биоактивных пептидов, включая галанин и нейропептид Y, которые обильно экспрессируются в головном мозге. По мере того, как увеличивалась информация об участии этих пептидов в фундаментальных физиологических и поведенческих функциях, таких как питание, тревога, учеба, память и внимание, стало ясно, что пептиды также могут модулировать возбудимость нейронов выгодным образом для защиты отсудорожных припадков.
Предпочтительное высвобождение нейропептидов в условиях повышенной активности нейронов и, в частности, при судорогах, стимулировало исследование их роли в модуляции судорог. Оба галанин (а 29- до 30-аминокислотный пептидный) и нейропептид Y (полипептид из 36 аминокислот) , как было показано являются антагонистами возбуждающей глутаматергической нейротрансмиссии в гиппокампе. Убедительные доказательства поддерживают противосудорожную роль этих пептидов в различных экспериментальных моделях судорог, либо когда экзогенно применяются или когда используются эндогенно. Нейропротекция против гибели эксайтотоксических клеток и вызванный судорогами нейрогенез являются двумя новыми аспектами пептидного действия в ЦНС, которые имеют отношение к исследованиям эпилепсии. Результаты этих исследований привели к гипотезе , согласно котрой увеличение локального тонуса торможения , вызванное избыточной экспрессией этих двух нейроактивных пептидов в определенных областях мозга , может быть эффективной стратегией ингибирования судорог и эпилептогенеза . Сообщалось об ослаблении судорожной активности и гибели нейронов ААВ-векторами, которые опосредуют галанин-экспрессию и секрецию нейропептида Y.
ААВ-векторы с различными характеристиками были разработаны для сверхэкспрессии галанина в нейронах. В одном из исследований вектор AAV был сконструирован таким образом, чтобы переносить последовательность фибронектина вместе с геном галанина. AAV-опосредованная доставка этого секреторного сигнала вместе с кодирующей последовательностью активного пептида галанина значительно ослабляла чувствительность фокального приступа in vivo в нижней коре головного мозга крысы и предотвращала гибель клеток, вызванную припадками, спровоцированными каинатом. Когда доксициклин был добавлен в питьевую воду, порог генерации приступов возвращался к исходному уровню в течение 1 недели. Это исследование демонстрирует возможность как контролируемого, так и долгосрочного (≤4 недель) затухания приступа с помощью вектора генной терапии. В другом исследовании Lin et al. ( 2003) был использован вектор rAAV, в котором ген галанина приводил в действие нейрон-специфический промотор. Исследование показало длительную (≤2,5 месяца) функциональную избыточную экспрессию галанина, продемонстрировав, что пептид можно продуцировать и транспортировать по аксонам даже на большом расстоянии от его места синтеза. Ограниченная избыточная экспрессия галанина приводит к выраженному ингибированию судорог, вызванных каппинговой инъекцией каиновой кислоты, что было подтверждено на электроэнцефалограмме (ЭЭГ).
Добавить комментарий