Забор крови является инвазивным для человека. В отличие от сбора выдыхаемого воздуха и мочи, забор крови, как правило, дороже, для него требуются сертифицированные медицинские работники, образуется больше контагиозных отходов (например, игл, тампонов, бинтов), повышается риск инфицирования, и его необходимо проводить в контролируемой клинической среде. Кроме того, образцы крови необходимо обрабатывать быстро (до замораживания), если аналитические протоколы требуют отделения плазмы/сыворотки от эритроцитов или выделения генетического материала . Некоторые измерения переносимых кровью биомаркеров для оценки воздействия/дозы внешей среды используются для проверки интерпретации обычных данных биомаркеров из менее инвазивных матриц, таких как дыхание и моча. Это особенно верно для полулетучих и нелетучих органических соединений из окружающей среды, таких как пестициды, полиароматические углеводороды (PAH) и различные промышленные химические вещества, используемые в потребительских товарах и промышленности .
Существует четыре взаимосвязанных направления исследований для расширения применения биомаркеров крови в области гигиены окружающей среды. Во-первых, это непрерывная разработка новых биомаркеров, которые могли бы преодолеть разрыв между воздействием и последствиями для здоровья, включая эпигенетические маркеры (например, микроРНК), аддукты сверхследового уровня на специфических белковых пептидах и маркеры эндогенного ответа (например, плазменные и клеточные маркеры), наконец , производные медиаторы, такие как цитокины и хемокины. Второй — разработка методов постобработки для эффективного извлечения специфических компонентов крови из предварительно замороженных образцов, особенно человеческого сывороточного альбумина, гемоглобина и ДНК. Третий путь заключается в разработке менее интрузивных методов отбора проб, более подходящих для популяционных исследований за пределами клинической среды, включая микропунктурные капилляры, измерения в реальном времени, и стабилизация образца с помощью засохших пятен крови. Четвертый включает в себя высокопроизводительные методы, такие как технологии «omics», которые способны одновременно анализировать тысячи белков или метаболитов для выявления различий в уровнях экспрессии и паттернах.
Хотя использование крови для анализа биомаркеров имеет много преимуществ, некоторые методологические проблемы служат недостатками. Одной из проблем является потребность в медицинской бригаде для сбора образцов, что увеличивает стоимость анализа и делает трудным, если не невозможным, сбор образцов крови в отдаленных полевых условиях. Анализ крови также создает биологически опасные отходы, которые необходимо правильно утилизировать. Все образцы крови следует считать заразными и обращаться с ними следует с осторожностью. Еще одним серьезным недостатком анализа крови является то, что испытуемые с большей неохотой предоставляют образцы крови, чем образцы дыхания или мочи. В исследовании детской лейкемии только 50% субъектов предоставили образцы крови, в то время как 95% сдали образцы буккальных клеток. Некоторые лица, такие как дети, пожилые люди, хронически больные и беременные женщины, не включаются в анализы крови по этическим соображениям, в то время как другие считают это просто ненужным и предпочитают не участвовать. Кровь также может иметь более низкие концентрации аналита по сравнению с другими матрицами. Моча обычно имеет концентрацию в диапазоне частей на миллиард (ppb), в то время как концентрации в крови, как правило, составляют части на триллион (ppt). Для некоторых соединений, таких как эфиры фталевой кислоты (PE), моча является предпочтительной матрицей, поскольку уровни метаболитов в моче в 10 раз выше, чем в сыворотке . Однако по мере того, как аналитические методы продолжают совершенствоваться и становиться все более чувствительными, проблема концентрации становится менее сложной.
Наука о воздействии традиционно сосредоточивалась на характеристике того, как взаимодействие человека с его или ее окружающей средой приводит от стрессоров (химических или иных) к неблагоприятным последствиям для здоровья. Затем необходимо проанализировать то, как человек взаимодействует с окружающей средой, чтобы определить риск воздействия (продолжительность и частота контактов, уровень активности и путь воздействия) Затем химические биомаркеры и их смеси используются для количественной оценки воздействия, показывая, сколько стрессора попало в организм, и отслеживая его перемещение в различные биологические компартменты . Затем эта информация передается токсикологам для оценки потенциального воздействия на здоровье на основе уровней химических веществ, распределенных по всему телу. Наука о воздействии сильно зависит от экспериментальных данных; однако в исследованиях все чаще используются прогностические модели в попытке более оперативно охарактеризовать потенциальное воздействие. Биомаркеры, как известно, связывают науку о воздействии и токсикологические исследования, чтобы объяснить весь континуум «доза-результат», включая как информацию о воздействии (абсорбция, распределение, метаболизм и элиминация [ADME]), так и признаки биологических эффектов.
Биомаркеры, как правило, классифицируются по функциям как биомаркеры воздействия, эффекта и восприимчивости ( Boffetta 2010 ). Биомаркеры воздействия специфичны для химических веществ (сам стрессор или химический метаболит). Эти биомаркеры считаются экзогенными по происхождению и используются для оценки количества химического вещества в биологической системе. Биомаркеры эффекта не обязательно структурно схожи со стрессором; считается, что они имеют эндогенное происхождение, являются результатом взаимодействия с окружающей средой и обычно связаны с АОP в системной биологии человека. Биомаркеры восприимчивости демонстрируют индивидуальную склонность к сенсибилизированной реакции на интересующий стрессор. Эти биомаркеры обычно связаны с генетическими, эпигенетическими или индуцированными ферментами признаками и описывают вероятность того, что взаимодействие с окружающей средой может вызвать каскад, ведущий к неблагоприятным последствиям.
Классы биомаркеров крови
Существует четыре основных типа биомаркеров в дополнение к экзогенным химическим веществам, которые обычно обнаруживаются в крови: эндогенные химические вещества, воспалительные, молекулярные модификации и биоиндикаторы повреждения.
Эндогенные биомаркеры отражают наиболее раннее воздействие внешних воздействий на организм человека. Как правило, эти соединения представляют собой химические вещества, образующиеся в результате метаболизма углеводородов и кислорода, а также летучие кислородсодержащие соединения, включая спирты, альдегиды, кетоны, органические кислоты и белки. Доказательным аспектом является не их присутствие, а отклонение от того, что считается нормальным (или ничем не примечательным) паттерном. Например, повышенные уровни активных форм кислорода (ROS) свидетельствуют об окислительном стрессе ( Amann et al. 2014 ), который можно оценить путем мониторинга уровней глутатиона (GSH) и глутатиондисульфида (GSSG) в крови. Гены стресса часто индуцируются после воздействия стрессора окружающей среды и могут указывать на токсичность. Белки теплового шока, особенно Hsp70, часто экспрессируются в результате воздействия тяжелых металлов или пестицидов, и было обнаружено, что эти воздействия вызывают узнаваемые паттерны экспрессии белков теплового шока ( Gupta et al. 2010 ). Клинические маркеры, в том числе холестерин, триглицериды и ферменты печени в образцах крови, также могут считаться эндогенными биомаркерами и указывать на неблагоприятный риск для здоровья, когда наблюдаются аномальные уровни. Циркулирующая митохондриальная ДНК и микроРНК (миРНК) также были идентифицированы как биомаркеры воздействия пестицидов в окружающей среде и индикаторы раннего развития рака.
Воспалительные биоиндикаторы представляют собой первый уровень биологически значимых параметров, которые реагируют на внешний стрессор, что часто является первым шагом в АОP.Воспалительный ответ служит медиатором рекрутирования для восстановительной функции, стимулируемой внешними стрессорами, такими как загрязнение воздуха, и генерирует макрофаги для высвобождения хемокинов и провоспалительных цитокинов, которые можно использовать для отслеживания биологической реакции на стрессор. В некоторых сценариях также высвобождаются противовоспалительные мессенджеры, что отражает угнетение репаративной функции и может считаться неблагоприятным. Цитокины были идентифицированы как биомаркеры воздействия выхлопных газов и дыма, которые связаны с сердечно-сосудистыми заболеваниями. Цитокин интерлейкин-6 (IL-6) стимулирует экспрессию хемокинов, а также синтез и секрецию С-реактивного белка печенью в ответ на воспаление. С-реактивный белок является сывороточным биомаркером острофазового ответа и индикатором сердечно-сосудистых заболеваний. Хотя они могут быть полезными биомаркерами того, что некоторые воздействия произошли недавно, цитокины (и другие белковые маркеры) неспецифичны, имеют короткий период полувыведения из сыворотки и их трудно обнаружить. Фактически, острая реакция может быть задержана на несколько (или более) часов и может восстановиться в течение того же периода времени. Однако эти эндогенные маркеры полезны для оценки состояния здоровья и указывают на общий уровень нагрузки на биологическую систему. Воспалительные биомаркеры также не обладают тканевой специфичностью и узнаваемыми паттернами экспрессии, характерными для токсинов, и поэтому их трудно интерпретировать, когда возможны более одного механизма токсичности.
Биоиндикаторы молекулярной модификации обычно определяются как аддукты и конъюгаты больших молекул. К ним относятся белковые аддукты, особенно белки гемоглобина (Hb) и человеческого сывороточного альбумина (HSA), которые вместе составляют примерно 92% всех белков крови . Белковые аддукты считаются долгосрочными биомаркерами: Hb имеет период полувыведения примерно 60 дней, тогда как HSA имеет период полувыведения 30 дней. HSA функционирует как переносчик белков и жирных кислот ( Fanali et al. 2012 ), в то время как основная функция гемоглобина заключается в транспортировке кислорода из легких в ткани . Однако экзогенные химические вещества и их метаболиты могут прикрепляться к активным участкам этих белков, образуя аддукты, которые мешают их нормальным функциям.
Биоиндикаторы повреждения включают широкий спектр органических молекул и клеточных фрагментов от неблагоприятных биологических воздействий. Наиболее распространенным примером клинических маркеров повреждения являются ферменты печени, которые по существу представляют собой белки утечки из поврежденных клеток. Два фермента печени, аспартатаминотрансфераза (АСТ) и аланинаминотрансфераза (АЛТ), высвобождаются в кровоток при повреждении гепатоцеллюлярной ткани или гибели клеток. Анализы крови проводятся для оценки возможности заболевания печени и других вирусных инфекций из-за высоких уровней АСТ или АЛТ . Циркулирующие клетки крови являются удобным источником ДНК для оценки индикаторов ДНК-специфических повреждений. Показатели цитогенетического повреждения включают хромосомные аберрации (CA), обмен сестринскими хроматидами (SCE) и микроядра (MN). СА характеризуются хромосомными разрывами и перестройками, превышающими нормальный 1% встречаемости. При SCE целые нити ДНК разделяются и обмениваются между двумя сестринскими хроматидами, в то время как MN представляют собой целые хромосомы с центромерами, оставшимися за пределами основной нуклеазы из-за структурного повреждения или аномального митоза.
Биомаркеры крови
Кровь состоит из множества различных типов клеток, включая лимфоциты, гранулоциты и эритроциты, а также сыворотку и плазму ( Holland et al. 2005 ). Лимфоциты крови обычно используются для анализа CA и SCE. Нейтрофилы - тип гранулоцитов, могут быть выделены для анализа ДНК, в то время как эритроциты являются хорошим источником для изучения аддуктов гемоглобина. Цельная кровь может быть полезной для оценки определенных биомаркеров. Например, тяжелые металлы, такие как марганец (Mn), свинец (Pb) и кадмий (Cd), обычно измеряются в цельной крови из-за их низких уровней в сыворотке и плазме, а также из-за отсутствия эпидемиологических данных по оценке воздействия на человека. Недавно была разработана многоцветная проточная цитометрия, способная различать основные подгруппы лейкоцитов в крови человека, бронхоальвеолярном лаваже и легочной ткани, и этот метод можно использовать для визуализации пропорций различных типов клеток крови без необходимости предварительного разделения. Этот метод проточной цитометрии можно использовать в науке о воздействии для сравнения пропорций типов клеток, присутствующих в образцах от подвергшихся и не подвергавшихся воздействию людей, как продемонстрировано для курильщиков и некурящих.
После забора крови образцы необходимо немедленно центрифугировать для создания градиента Фиколла, который разделяет кровь на плазму, лейкоциты и эритроциты. Образцы крови необходимо обработать вскоре после сбора, и все образцы необходимо подвергнуть криоконсервации в течение 24 часов после сбора. Различные типы клеток и компонентов требуют уникальных условий хранения. Например, клетки необходимо отделять от сыворотки сразу после сбора образцов для правильного анализа цитокинов. Если желаемая мишень неизвестна, образцы крови можно хранить при температуре 4°C в течение нескольких дней, чтобы защитить клетки от ферментативной деградации при сохранении жизнеспособности клеток. В зависимости от интересующей цели к образцу могут быть добавлены ингибиторы протеазы для замедления деградации. Однако эти ингибиторы токсичны для живых клеток и не должны использоваться, если необходима жизнеспособность клеток. Если анализируются новые мишени, может потребоваться проведение предварительного эксперимента для определения оптимальных условий и времени хранения перед сбором образцов у испытуемых.
Добавить комментарий