Концепция использования нуклеиновых кислот в качестве лекарств сложилась в 70-х годах прошлого века ондовременно с разработкой методов синтеза ДНК и РНК-олигонуклеотидов. Синтетические нуклеиновые кислоты обладают способностью специфически связываться с последовательностью РНК-мессенджера (мРНК) и контролировать экспрессию любого гена. Поскольку эти олигонуклеотиды были комплементарны мРНК смысловой цепи, они стали известны как ASO.
Вторая технология для подавления экспрессии генов появилась 20 лет спустя с открытием того , что дуплексные РНК могут блокировать экспрессию генов в клетках человека через путь интерференции РНК. Дуплексные РНК могут быть мощными регуляторными агентами и имеют большие перспективы в качестве платформы для разработки лекарств.
Большинство лекарств представляют собой небольшие молекулы и имеют молекулярную массу менее 500 Да. Маленькие молекулы эффективны при нацеливании на активный сайт фермента или сайт связывания лиганда в рецепторе, потому что они могут плотно вписаться в молекулярные карманы и эффективно блокировать ключевые функции, например , рецептора. Однако некоторые белки имеют множество функций или не имеют соответствующих им связывающих карманов, способных образовывать адекватные взаимодействия. В других случаях недостаток белка является проблемой. Для этих заболеваний использование малых молекул иногда будет проблематичным, поскольку нет четкого обоснования того, почему маленькая молекула должна увеличивать экспрессию или активность определенного гена.
Потенциал ASO в плане их развития в качестве лекарств был сразу очевиден. Однако , исследователи столкнулись с серьезными препятствиями. Синтетические олигонуклеотиды - это крупные (3000 Да), сильно отрицательно заряженные молекулы, которые мало похожи на традиционные лекарства. Кроме того, нуклеиновые кислоты подвержены деградации нуклеазами и могут вызывать иммунный ответ. Синтез олигонуклеотида требует десятков химических стадий, каждая из которых должна быть почти идеально эффективной. Наконец, химический состав ASO необходимо оптимизировать для обеспечения эффективного распознавания мишеней внутри клеток.
Коммерческое развитие проекток ASO началось в 80-х годах прошлого века и характеризовалось многократными колебаниями между оптимизмом и разочарованием, потому что клинические исследования показали определенную перспективу и затем исчезли , когда результаты 3 были опубликованы. Одно из соединений - фомивирсен, было одобрено Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США в 1998 году для лечения цитомегаловирусного ретинита после внутриглазного введения. Ещеодин препарат - ломитапид был направлен на экспрессию аполипопротеина В, тем самым снижая уровень холестерина и добился позитивных результатов при системном введенияи пациентам с гомозиготной семейной гиперхолестеринемией.
Синтетические олигонуклеотиды химически модифицируют в целях улучшения биораспределения, фармакокинетики и эффективности своего эффекта внутри клеток. Как правило, ASO имеют фосфоротиоатные связи между нуклеотидами. Эти связи повышают устойчивость к расщеплению нуклеазой и увеличивают биодоступность за счет улучшения связывания с сывороточными белками. Чтобы увеличить сродство связывания с РНК-мишенями, большинство ASO модифицированы в 2 'положении рибозы. Блокированная нуклеиновая кислота и аналогичные нуклеотиды нуклеиновой кислоты с мостиковыми связями содержат связи между положениями 2 'и 4' рибозы, которые служат для «блокировки» кольца в конформации, которая идеально подходит для связывания. Лучшая аффинность связывания может быть преобразована в более эффективное распознавание последовательностей-мишеней внутри клеток.
В некоторых случаях разрушение РНК и ингибирование экспрессии генов являются желаемыми результатами. В этих случаях используются «гамперы» ASO. Гапмеры представляют собой синтетические ASO, которые содержат фланкирующие области, содержащие 2'-нуклеотидные модификации и центральную часть ДНК. Фланкирующие области усиливают сродство к комплементарным последовательностям. При связывании разрыв ДНК образует гибрид ДНК-РНК, который может рекрутировать РНКазу Н и вызывать расщепление целевой мРНК.
Другое приложение для ASO - перенаправление альтернативного сплайсинга. Для этого применения ASO не требуется рекрутировать РНКазу H. Вместо этого химически модифицированные нуклеотиды распределяются по всему ASO для увеличения аффинности связывания.Соединения разрабатываются так, чтобы быть специфичными для последовательностей вблизи соединений интрон / экзон.
Успешное развитие ASO выиграет от анализа потенциала конкурирующих технологий. Например, ASO могут не быть предпочтительными, если есть ожидание, что конкурирующая малая молекула или антитело могут быть успешно разработаны. Эти более устоявшиеся технологии, вероятно, будут иметь преимущества, по крайней мере, в ближайшей и среднесрочной перспективе. Были проведены исследования, что ASO могут быть перорально биодоступными, но эффективность здесь оказалось низкой. Отсюда следует, что пероральная биодоступность, вероятно, не совсем подходит для текущего состояния технологии ASO. По крайней мере, в ближайшей перспективе ASO незнакомы пациентам, врачам и регулирующим органам. В качестве альтернативы, показания, при которых возможно местное применение, могут потребовать меньшего количества ASO, снижения его стоимости и отделения ASO от воздействия на органы всего организма, то есть снижения вероятности появления системных токсических эффектов и непредвиденных отрицательных результатов. Для неврологии было показано, что интратекальное введение обеспечивает широкое распространение по всей центральной нервной системе. Исследования эффективности ASO, при которых изменения в белковой мишени или биомаркере может быть определено посредством биопсии или взятия крови, обеспечат раннее доказательство того, что ASO взаимодействует с мишенью и вызывает желаемые молекулярные изменения.
Атаксия Фридрейха
Атаксия Фридрейха - это полиорганная болезнь, которая поражает центральную нервную систему, сердце, поджелудочную железу и другие заболевания.
Атаксия Фридрейха вызвана расширенным тринуклеотидным повторением AAG в гене фратаксина ( FXN ). Примечательно, что этот расширенный повтор AAG находится в интроне и вызывает снижение экспрессии белка FXN, даже если он не находится в кодирующей области. Нормальный белок FXN производится, но уровень не является достаточным. Следовательно, методы лечения, которые восстанавливают уровни FXN, предлагают подход к лечению, который нейтрализует основную причину заболевания.
Как может мутация с интроном, которая обычно сплайсируется из зрелой мРНК перед трансляцией белка, снижать экспрессию белка? Наиболее вероятный механизм включает связывание расширенного тринуклеотидного повтора AAG с хромосомной ДНК посредством образования R-петли, в которой мутантная РНК распознает соответствующую последовательность ДНК путем спаривания оснований Уотсона-Крика. Это связывание препятствует транскрипции в локусе FXN , снижает продукцию РНК и приводит к снижению уровня белка FXN.
Напрашивается вывод, что олигонуклеотиды, которые блокируют расширенный повтор, могут предотвратить образование R-петли и освободить разрыв при транскрипции. Исследователями предлагаются дуплексные РНК или ASO, дополняющие повтор AAG. Оба подхода привели к увеличению экспрессии РНК и белка. Уровни белка FXN были аналогичны уровням, наблюдаемым в клетках дикого типа. Исследование показало, что синтетические нуклеиновые кислоты могут быть использованы для восстановления уровней FXN, обеспечивая отправную точку для терапевтического эффекта. Эти данные предполагают, что механизм действия ASO или дуплексных РНК включает в себя связывание с расширенным повтором и физическое предотвращение его ассоциирования хромосомной ДНК с образованием критической структуры R-петли.
"Антисмысловые олигонуклеотиды" ( ASO) эффективно ингибируют экспрессию генов в печени и центральной нервной системе. Использование их для лечения широкого спектра тканей, необходимых для полного лечения атаксии Фридрейха, потребует более сильнодействующих соединений и более эффективных стратегий доставки олигонуклеотидов во все пораженные ткани.
Спинальная мышечная атрофия
Спинальная мышечная атрофия является аутосомно-рецессивным заболеванием, характеризующимся мышечной атрофией и параличом. Это наиболее частая генетическая причина смерти у детей, затрагивающая спинномозговые нейроны ствола мозга и двигательные нейроны.Спинальная мышечная атрофия вызвана мутацией в гене мотонейрона выживания 1 ( SMN1 ), который снижает уровень активного белка SMN1. У людей также есть второй ген SMN , SMN2 , но этот ген имеет мутацию C to T в экзоне 7, которая влияет на сплайсинг и приводит к нестабильной изоформе. Если бы эту проблему сплайсинга можно было исправить, ген SMN2 мог бы вырабатывать активный белок и облегчать симптомы атрофии мышц позвоночника.
"Антисмысловые олигонуклеотиды" ( ASO) могут влиять на альтернативный сплайсинг, блокируя ключевые последовательности, которые регулируют действие белков-сплайсинговых факторов. "Антисмысловые олигонуклеотиды", которые нацелены на интрон 7 в пределах SMN2, могут увеличивать включение экзона 7 и продукцию функционального белка SMN. Эта коррекция сплайсинга увеличивает белок SMN в моторных нейронах и купирует симптомы у модельных мышей с мышечной атрофией позвоночника. Недавно были опубликованы данные клинических испытаний фазы 1 для корректирующего сплайсинг ASO - нусинерсена (nusinersen), и они выглядят многообещающими.
Добавить комментарий