Исследования в области генетических технологий, такие как анализ микрочипов и массивно-параллельное секвенирование, позволили нам анализировать генетическую информацию на уровне всего генома. В некоторых из этих генетических исследований были выявлены гены-кандидаты, облегчающие диагностику и лечение различных психических расстройств. Например, крупномасштабное исследование ассоциации всего генома (GWAS) идентифицировало 108 геномных локусов, связанных с шизофренией, с использованием технологии микрочипов однонуклеотидного полиморфизма (SNP). Дополнительные исследования выявили несколько вариаций числа копий (CNV), связанных либо с шизофренией , либо с расстройством аутистического спектра (ASD). Несмотря на обширные генетические исследования, выявленные к настоящему времени SNP и CNV могут лишь частично объяснить склонность к психическим расстройствам. Даже 108 значимых локусов и 8 CNVs, идентифицированных в крупномасштабных исследованиях, могут объяснить только 3,4% и 0,85% дисперсии склонности к шизофрении, соответственно. Вклад геномных особенностей в ASD больше, чем в шизофрению, у 6,02% пациентов с ASD обнаружены известные редкие варианты. Даже после рассмотрения вклада редких мутаций, общая ответственность за эти нарушения не может быть объяснена.
Несмотря на то , что оставшаяся склонность к психическим расстройствам классически объясняется факторами окружающей среды, последние психиатрические исследования были сосредоточены на роли мутаций de novo, которые представляют собой тип не наследуемого генетического фактора. Мутации de novo происходят до оплодотворения, до или во время сперматогенеза / ооцитогенеза. Некоторые мутации de novo, происходящие до сперматогенеза / ооцитогенеза, происходят из геномного химеризма у любого из родителей, который можно обнаружить в части соматических тканей родителя. Напротив, мутации de novo, возникающие во время сперматогенеза / ооцитогенеза, не могут быть обнаружены в тканях родителей, за исключением ограниченного числа половых клеток. Трио-анализ показал, что мутации de novo в SETD1A , CHD8 и других критических вариантах связаны с повышенным риском множественных психических расстройств. Большие исследования типа «случай-контроль» подтвердили эти выводы относительно SETD1A и CHD8 у пациентов с шизофренией и ASD, соответственно.
В дополнение к мутациям зародышевой линии de novo после оплодотворения могут возникать соматические или постзиготические мутации. После таких мутаций геном в каждой соматической клетке не полностью идентичен у одного человека. Соматические мутации также характеризуются как патологический механизм, связанный с раком , и как адаптивный физиологический механизм, связанный с соматической перестройкой генов иммуноглобулина. Рак вызывается соматическими мутациями в генах ключевого драйвера в конкретной ткани, и многочисленные дополнительные соматические мутации могут возникать с развитием. В дополнение к раковым тканям, последние геномные исследования систематически идентифицировали соматические мутации на уровне генома в незлокачественных тканях человека. Кроме того, некоторые мутации, первоначально обозначенные как мутации зародышевой линии de novo, впоследствии были идентифицированы как соматические мутации, возникшие после оплодотворения у детей или до сперматогенеза / ооцитогенеза у родителей.
Известно, что некоторые заболевания человека возникают в результате соматических мутаций, и данные многих исследований указывают на то, что соматические мутации могут частично объяснить склонность к психическим расстройствам. Такие мутации могут наблюдаться в различных тканях в течение раннего периода развития, включая периферические ткани (например, клетки крови), а также клетки головного мозга. Напротив, соматические мутации, возникающие после дифференцировки, существуют в ограниченной области одного типа ткани (например, мозга) и, таким образом, могут быть обнаружены только в этой ткани. Соматические мутации возникают из-за воздействия окружающей среды, включая воспаление и окислительный стресс (описанный ниже), а также из-за стохастических изменений во время развития.
В то время как полиморфизмы и варианты, передаваемые от предков, являются наследственными генетическими факторами, остальные три типа мутаций de novo и соматических мутаций, являются ненаследственными генетическими факторами. Тем не менее, все эти типа зародышевой линии и соматические варианты (мутации), вероятно, оказывают аддитивное влияние на отдельный фенотип. Например, исследования показали, что мутации зародышевой линии de novo и наследуемые варианты аддитивно влияют на риск развития расстройства аутистического спектра.
В принципе, мутации, которые приводят к эмбриональной летальности или тяжелым врожденным заболеваниям, не могут существовать в геноме зародышевой линии, хотя они могут существовать в виде соматических мутаций, что может привести к относительно менее серьезным физиологическим последствиям. Предыдущие исследования, касающиеся эпилептической энцефалопатии, показали, что одиночные соматические мутации PCDH19 приводят к менее тяжелой патологии, чем мутации de novo того же гена.
Полиморфизмы и варианты, передаваемые от предков и мутаций de novo, общих для монозиготных близнецов, способствуют наследуемости, оцененной в исследованиях близнецов. Тем не менее, соматические мутации, не разделяемые между монозиготными близнецами, не вносят непосредственного вклада в наследственность, но влияют на склонность к психическим расстройствам у пациентов, изменяя биологические пути, сходные с теми, на которые влияют мутации зародышевой линии. Соматические мутации могут вносить вклад в общую изменчивость ответственности, которая, как классически считается, связана с факторами окружающей среды.
Расчетная частота мутаций de novo составляет 1–1,5 × 10–8 на нуклеотид на поколение. Соматические мутации могут встречаться чаще, чем мутации de novo. При условии консервативной оценки 2,8 замещающих мутаций на клетку на клеточное деление и симметричных делений в развитии, 86 миллиардов нейронов прошло бы по крайней мере 36 делений, что привело бы к минимуму 100 однонуклеотидных вариантов (SNVs) в одном нейроне. Фактически, нейроны, вероятно, подвергаются гораздо большему количеству клеточных делений, и мутация в нервных тканях происходит через механизмы, отличные от ошибок репликации во время клеточного деления. Кроме того, могут возникать другие типы мутаций (например, структурные варианты), увеличивая количество мутационных событий сверх этой минимальной оценки.
Исследовательские группы опубликовали обзоры, которые систематизируют последние знания о соматических мутациях в человеческом мозге с нейропсихиатрической / нейробиологической точки зрения.
Соматические мутации в митохондриях также играют критическую роль в этиопатогенезе психических расстройствах, однако, эти исследования требуют отдельного анализа , в этой заметке речь идет о соматических мутациях в геномной ДНК.
Одна нейрональная прогениторная клетка в коре плода имеет ~ 200–400 соматических SNVs , в то время как один зрелый нейрон во взрослой коре имеет ~ 1000–2500 соматических SNVs. Эти оценки основаны на секвенировании цельного генома (WGS) одноклеточных геномов после пролиферации клональных клеток или амплификации цельного генома (WGA). SNV в одном нейроне в префронтальной коре и зубчатой извилине увеличиваются на ~ 23 и ~ 40 в год соответственно. Скорость накопления в нейронах зубчатой извилины в два раза выше, чем в нейронах префронтальной коры, вероятно, из-за различий в скорости нейрогенеза. Некоторые мутации в отдельных нейронах также обнаруживаются в других областях мозга с различными аллельными фракциями. Предполагается, что аллельные фракции в определенных областях мозга коррелируют с моментом возникновения мутации, так что более крупные аллельные фракции могут отражать мутацию на более ранних стадиях развития. Исследователи предоставили оценку 5,1 SNV / день / отдельная клетка-предшественник во время нейрогенеза, 8,6 SNV / клетка / клетка-предшественник и 1,3 SNV / клетка / дочерняя клетка в раннем эмбрионе человека. Нейрогенез связан с более высокой частотой мутаций, чем в раннем эмбриогенезе, хотя частота нейрогенеза у взрослых в мозге человека активно обсуждается.
Переход цитозина (C) в тимин (T) является заметным типом мутации в нейронных соматических SNVs. Частота приблизительно 80% C> T выше, чем частота, наблюдаемая при мутациях зародышевой линии , хотя часть обнаруженного C> T может быть получена из экспериментальных артефактов. Переход C> T обогащен 5-метилированными цитозинами (5 мС) в динуклеотидах CpG и CpH, что позволяет предположить, что эти мутации происходят от метилирования / деметилирования ДНК. С возрастом фракция C> T уменьшается, а фракции цитозина в аденин (C> A) и T> C в коре увеличиваются. Нейрон зубчатой извилины является одним исключением, где фракция C> T увеличивается с возрастом, вероятно, из-за нейрогенеза. Трансверсия C> A, вероятно, вызвана окислительным повреждением ДНК. Исследователи также предположили, что увеличение T> C связано с повреждением ДНК окислением жирных кислот.
Наблюдаемые соматические мутации обогащены генами, связанными с нейроразвитием, и нитями, подвергающимися активной транскрипции. Большая длина нейрон-экспрессируемых генов может быть причиной мутационной восприимчивости. Соматические мутации в зрелых нейронах, вероятно, возникают во время активной транскрипции, тогда как соматические мутации в эмбриональных нейронах встречаются реже в геномных областях с гистоновыми метками мозга плода и эмбриональных стволовых клеток. Геномные участки, подверженные мутации, могут различаться в зависимости от стадии развития. Смещение соматических мутаций к генам нейроразвития в зрелых нейронах указывает на их отношение к психическим расстройствам.
Соматические мутации показали значительное пространственное разнообразие; некоторые мутации наблюдались в мозге, но не в печени, тогда как другие наблюдались в коре, но не в мозжечке.
Соматические CNVs также были зарегистрированы на уровне отдельных клеток. Нейроны демонстрируют больше делеций и специфичных для отдельных клеток CNV, чем лимфобластоидные клетки, что, вероятно, отражает низкий уровень пролиферации в нейронах. Примечательно, что 98% нейронов CNV являютсяделециями, в то время как только около 50% CNVs в лимфобластных клетках - делеции.
Несколько исследовательских групп выявили соматическую анеуплоидию в мозге человека.
Мобильные элементы
Подвижные элементы занимают ~ 45% генома человека. Длинный вкрапленный ядерный элемент-1 (LINE-1) является одним из основных подвижных элементов, проявляющих активные способности к транспозиции и занимающих 17% генома человека. Последовательность LINE-1 может пролиферировать в геноме человека посредством следующих процессов, называемых ретротранспозицией: (i) транскрипция мРНК с внутреннего промотора; (ii) трансляция мРНК LINE-1 с образованием комплекса РНК-белок LINE-1 с эндонуклеазной и обратной транскриптазной активностью; (iii) обратная транскрипция к ДНК и одновременная вставка в геном человека. Известно, что некоторые наследственные генетические заболевания, такие как гемофилия, являются результатом ретротранспозиции зародышевой линии LINE-1. Ретротранспозиционная активность LINE-1 обычно подавляется эпигенетическими системами, включая метилирование ДНК и модификацию гистонов. Однако ретротранспозиционная активность LINE-1 была идентифицирована в нейрональном геноме человека.
Скорость соматической ретротранспозиции в мозге человека активно изучается. Исследователи наблюдали соматическую ретротранспозицию LINE-1 и Alu в объемной ткани, полученной из гиппокампа и хвостатого ядра человека. Соматическая ретротранспозиция была обнаружена с использованием секвенирования ретротранспозонов (RC-Seq), в котором ретротранспозоны в геноме были секвенированы в массовом порядке после захвата. Сайты вставки ретротранспозонов были идентифицированы фланкирующими геномными последовательностями. Авторы выявили 13 700 и 7700 предполагаемых соматических ретротранспозиций LINE-1 и Alu, соответственно, у трех индивидуумов ( Baillie et al., 2011).
Поскольку нервная ткань проявляет мало или вообще не обладает пролиферативной способностью, механизмы, лежащие в основе соматической мутации в мозге, должны отличаться от механизмов, связанных с раком. Исследования показали, что C> T- переходы составляют ~ 80% соматических SNV в одиночных нейронах. Нейроны имеют характерные 5 мС в не-CpG-сайтах и относительно большее количество 5-гидроксиметилцитозина (5hmC), чем в других тканях. Более того, 5hmC является промежуточным продуктом при активном деметилировании 5mC до C, и предыдущие исследования показали, что этот процесс, включая восстановление базовой эксцизии, подвержен мутации. Тем не менее, одно исследование показало, что 5hmC был связан с ~ 53% снижением частоты мутаций C> T в сайтах CpG по сравнению с 5mC.
Нейронная активность вызывает двухцепочечные разрывы в геномной ДНК , и мутации могут возникать в процессе репарации неврной ткани. Несколько исследований показали, что эти двухцепочечные разрывы обогащены генами, связанными с нейронной или синаптической активностью . Двухцепочечные разрывы представляют собой один из возможных механизмов, лежащих в основе развития соматических мутаций в мозге человека.
Окислительный стресс
Окислительное повреждение не ограничивается мозгом, но на мозг приходится ~ 20% всего потребления кислорода в организме человека, таким образом, он несет большее количество окислительного повреждения, чем другие органы. По оценкам специалистов , окислительное повреждение вызывает ~ 1000 одноцепочечных разрывов на клетку в день. При окислительном повреждении образуется 8-оксогуанин, который иногда включает аденин в качестве неправильной комплементарной основы. Если системы репарации ДНК не могут восстановить исходную пару (гуанин и цитозин), неправильно введенный аденин включает тимин в качестве правильного комплементарного основания, что приводит к трансверсии C> A.
Исследования показали, что окислительное повреждение обогащено в областях промотора генов, связанных с синаптической пластичностью, везикулярным транспортом, передачей сигналов кальция и функцией митохондрий, и что такое повреждение уменьшает экспрессию этих генов. Нарушение функции митохондрий также может способствовать повреждению ДНК, увеличивая количество активных форм кислорода или уменьшая АТФ, доступный для восстановления ДНК. Окислительное повреждение ДНК в мозге человека накапливается с возрастом, особенно в митохондриях , и было показано, что оно связано с нейродегенерацией.
Ретранспозиция
Механизм, лежащий в основе ретротранспозиции в мозге человека, остается в значительной степени неизвестным. Однако, предполагается, что эпигенетическая модификация подавляет транскрипционную активность ретротранспозонов. Данные исследователей свидетельствуют о том, что воспалительный стресс в период развития плода вызывает соматическую ретротранспозицию, предполагают, что факторы окружающей среды приводят к соматической ретротранспозиции, вероятно, в результате нейровоспаления.
Ретротранспозоны или повторяющиеся последовательности могут индуцировать негомологичную рекомбинацию ДНК , что приводит к нестабильности генома и соматическим SNVs во время развития. Кроме того, LINE-1 может индуцировать делецию между областями LINE-1 посредством эндонуклеазной активности даже без транскрипции или новой инсерции. Однако механизмы, лежащие в основе образования соматических SNV, CNV и ретротранспозиции, еще предстоит полностью выяснить.
Соматические мутации при пороках развития мозга и нейродегенерации
Несколько исследований выявили соматические мутации в известных генах риска для определенных пороков развития головного мозга. Во многих случаях потенциальные соматические мутации были обнаружены в областях мозга, проявляющих местные анатомические изменения.
Гемимегалэнцефалия ( Hemimegalencephaly) относится к заболеванию, при котором одно полушарие головного мозга становится больше, чем другое. В нескольких исследованиях, использующих секвенирование всего экзома (WES) или TAS, наблюдались соматические SNVs в PIK3CA , AKT3 или MTOR в заросшем участке мозга (иссеченные во время хирургического лечения). Исследователи сообщали о соматических мутациях с долями аллелей 8–40% в пораженных областях у 6 из 20 пациентов с гемимегаленцефалией после масс-спектрометрического анализа. Другие группы сообщили об аллельной фракции в пределах аналогичного диапазона или выше. Моноклеточный анализ CNV выявил 1q тетрасомию в 20% из 76 отдельных клеток (46 нейронов и 30 не-нейронов), полученных из пораженной области мозга одного пациента с гемимегаленцефалией. Учитывая, что AKT3 находится на 1q, эти данные указывают на то, что соматические CNVs 1q также могут вызывать гемимегаленцефалию.
Корковая дисплазия с эпилепсией является еще одним примером порока развития головного мозга, вызванного соматическими мутациями, так идентифицировали соматические мутации в MTOR в пораженной области мозга у пациентов с кортикальной дисплазией II типа и эпилепсией. Они обнаружили предполагаемые соматические мутации с использованием WES на глубине 400–700 ×, подтвердив и количественно определив мутацию-кандидата с помощью TAS. Двенадцать из 77 пациентов имели соматические мутации в MTOR с аллельными фракциями от 1,3 до 12,6% в пораженных областях ( Lim et al., 2015).
Соматические мутации в GNAQ (c.548G> A, p.Arg183Glu) были зарегистрированы у пациентов с синдромом Стерджа-Вебера (редкое врожденное неврологическое расстройство, характеризующееся приступами, умственной отсталостью, церебральными пороками развития и другими симптомами).
Считается, что триплетное повторное расширение является причиной мутации нескольких нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Хантингтона и синдром хрупкой Х хромосомы. Триплетные повторы нестабильны в соматических клетках, в том числе в головном мозге. Расширение соматического триплетного повтора было выявлено в мозге пациентов с болезнью Хантингтона, особенно в областях мозга с агрессивной нейродегенерацией, и коррелировало с началом заболевания в раннем возрасте .
Соматические мутации и психические расстройства ( посмертные исследования)
Психические расстройства часто связаны с меньшим количеством анатомических изменений, чем пороки развития головного мозга, что делает относительно трудным исследование соматических мутаций, связанных с этими патологическими состояниями. Длина теломер, как правило, варьируется в соматических клетках. Характерное уменьшение длины теломер наблюдается в гиппокампе у пациентов с большим депрессивным расстройством.
При шизофрении эксперименты WGS Kim et al. выявили соматические делеции в BOD1 , CBX3 , PRKRA , MIR548N , MRPL42 ,SUCLG2 , TDG , а другую межгенную область в префронтальной коре головного мозга, мозжечке и белое вещество у трех пациентов, страдающей шизофренией. Эти соматические делеции были подтверждены с помощью секвенирования Сэнгера, длина которого варьировалась от 466 до 5604 п.н. Следует отметить, что аналогичные соматические делеции размером приблизительно 500 п.н. были обнаружены в хромосоме 2 ( PRKRA и MIR548N) в образцах от двух независимых пациентов, указывая на то, что этот регион проявляет уязвимость к мутации. В другом исследовании сообщалось об избыточной анеуплоидии в посмертных образцах головного мозга пациентов с шизофренией. Ранее сообщалось об увеличении количества копий LINE-1 в посмертном мозге (лобная кора) пациентов с шизофренией в двух независимых когортах. Увеличение числа копий LINE1 было характерно для геномов из изолированных нейронных ядер, что предполагает соматическую ретротранспозицию в нейронах при шизофрении. Увеличение количества копий LINE-1 также наблюдалось в посмертном мозге пациентов с синдромом Ретта и телеангиэктазией атаксией.
Несколько соматических SNV были связаны с расстройствами аутистического спектра . Пять соматических SNV, в том числе три соматических SNV на CACNA1C ,SCN1A и SETD2 , были обнаружены в посмертных мозгах пяти пациентов с синдромом аутистического расстройства или синдромом ломкой X хромосомы.
Гены риска и области мозга, связанные с болезнью Альцгеймера (AD), были относительно более выяснены, чем связанные с другими психическими расстройствами, и несколько исследовательских групп идентифицировали соматические мутации в мозге пациентов с AD. Энторинальная кора головного мозга проявляет патологию AD на самых ранних стадиях заболевания и APP , PSEN1.и PSEN2являются наиболее сильными из известных генов риска развития AD.
Соматические мутации и психические расстройства ( анализ переферической ткани)
Четыре группы авторов исследовали соматические мутации с использованием данных WES для образцов крови, полученных из больших групп семей с расстройствами аутистического спектра (Simons Simplex Collection). Эти данные WES были первоначально получены для исследования мутаций зародышевой линии. Эти четыре группы обнаружили несколько сотен соматических мутаций в клетках крови, включая мутации CHD2 ,RELN , SCN2A , SYNGAP1 и других известных генов риска ASD. От 7 до 22 процентов мутаций, первоначально идентифицированных как мутации зародышевой линии de novo были обнаружены , как постзиготические соматические мутации. Накопленные данные свидетельствуют о том, что соматические мутации, обнаруженные в этих образцах крови, дают приблизительно 3–5% диагноза аутизма.
Синдром Ретта, для которого характерны повторяющиеся стереотипные движения и аутистические особенности, вызывается мутациями в MECP2, расположенном на Х-хромосоме. Синдром Ретта обычно встречается только у женщин, так как отсутствие функционального MECP2 приводит к эмбриональной летальности. Большинство пациентов с синдромом Ретта обнаруживают мутации зародышевой линии de novo в MECP2 , хотя у некоторых обнаруживаются соматические мутации в MECP2 в клетках крови. Соматические мутации должны быть разделены между мозгом и клетками периферической крови, что приводит к характерным симптомам синдрома Ретта. Хотя синдром Ретта очень редко встречается у пациентов мужского пола, вероятно, из-за соматических мутаций в MECP2.
Методики исследования ( валидация)
Глубина секвенирования имеет решающее значение для надежной идентификации соматических мутаций. При использовании данных WES, полученных из образцов крови пациентов с расстройствами аутистического спектра , показатели валидации среди исследований варьировались от 50 до 90% в зависимости от методов и их чувствительности. Эти исследования не были проведены на достаточной глубине для исследования соматических мутаций, так как данные WES были первоначально получены для изучения мутаций зародышевой линии.
Кандидаты на соматическую мутацию должны быть подтверждены с использованием других генетических методов, таких как ddPCR, пиросеквенирование или секвенирование Сэнгера. Среди них ddPCR является более предпочтительным , поскольку он позволяет проводить точный расчет доли аллеля и обладает высокой чувствительностью обнаружения (0,001% ~). Пиросеквенирование и секвенирование Сэнгера со многими клонами также можно использовать для расчета доли аллеля, хотя разрешение и чувствительность ниже, чем у ddPCR (пиропоследовательность, ~ 5%). Однако, все эти методы демонстрируют трудности при обнаружении SNV в повторяющихся областях, включая ретротранспозоны, из-за сложности в ПЦР. TAS на сверхвысокой глубине (например, 10000 × ~) можно использовать в качестве альтернативного метода валидации, так как этот метод может обнаруживать соматические мутации с долями аллелей всего 0,1%. Тем не менее, существует вероятность систематических ошибок при использовании химии секвенирования, аналогичной исходной последовательности. Соматические CNV и ретротранспозоны в объемных тканях могут быть проверены с использованием КПЦР, хотя разрешение ограничено.
Стратегии секвенирования
Выбор целевого геномного региона является одним из наиболее важных вопросов. Хотя гены риска еще не определены для большинства психических расстройств, последние геномные исследования выявили несколько генов-кандидатов в качестве редких вариантов с сильным размером эффекта. Однако, если целевые гены неясны, требуются более комплексные методы, такие как WGS или WES. Выбор WGS, WES или TAS зависит от цели исследования, а также от конкретного расстройства.
Выбор секвенирующих машин также важен. В большинстве современных исследований соматических мутаций машины HiSeq или MiSeq (Иллюмина, Сан-Диего, Калифорния, США) используют в качестве массивно параллельных секвенсоров для WGS, WES или TAS. Технология Illumina Short-Read является экономически эффективной, но с помощью этого метода сложно анализировать области с большими гомологичными последовательностями или повторяющимися областями, включая ретротранспозоны. Методы секвенирования целевого обогащения, такие как RC-Seq и L1Hs-Seq , необходимы для анализа повторяющихся областей. Последовательность короткого чтения Illumina связана также с другими проблемами, такими как переключение индексов и систематические ошибки, что требует осторожности перед исследованием соматических мутаций.
Новые технологии секвенирования, включающие секвенирование с длительным считыванием, такие как PacBio / Sequel (Pacific Biosciences, Menlo Park, CA, USA) и MinION / PromethION (Oxford Nanopore Technology, Oxford, UK), были бы полезны для исследования структурных вариантов. и ретротранспозонов. Анализ CNV может быть выполнен с использованием микрочипов, но WGS с малой глубиной более чувствителен для обнаружения соматических CNV, а секвенсоры с длинным чтением полезны для обнаружения вариантов соматических структур, включая CNV.
Обнаружение кандидата
Ожидается, что аллельные доли соматических мутаций в нервной ткани будут низкими из-за низкой пролиферативной способности после дифференцировки. Это заметно контрастирует с раком, который характеризуется гиперпролиферацией и связан с соматическими мутациями, несущими большие аллельные фракции. Таким образом, высокочувствительный подход необходим для обнаружения соматических мутаций в мозге человека. Cibulskis et al. ( 2013) сообщили о чувствительности MuTect, хорошо известного инструмента обнаружения соматических мутаций с высокой чувствительностью и специфичностью, имитирующего различные случаи глубины секвенирования. Например, MuTect требует глубины последовательности 340 × ~ для достижения чувствительности 90% при обнаружении соматических мутаций с аллельными фракциями 2%. MuTect, VarScan и «Стрелка" (все три пакета имеют обновление версии 2) часто используются для обнаружения соматических мутаций, связанных с раком, путем сравнения тканей-мишеней и контроля. В одном сравнительном исследовании сообщалось, что MuTect обладает самой высокой чувствительностью и специфичностью среди протестированных устройств .
Примечательно, что ложные выводы из-за повреждения ДНК, ошибок ПЦР, ошибок последовательности и ошибок выравнивания включены в сообщения о соматических мутациях. Ложноположительные значения G> T или C> A из-за 8-оксогуанина во время подготовки образца ПЦР были в большом количестве в образцах человека, особенно в образцах рака. О секвенировании также сообщалось с использованием секвенатора Illumina. Осторожность также требуется при анализе отдельных клеток из-за искусственного спонтанного дезаминирования C> U, которое происходит во время лизиса клеток . Некоторые авторы предложили конвейер обнаружения соматических мутаций, который обеспечивает тщательное исключение возможных ложных выводов, впоследствии представив программное обеспечение для обнаружения соматических мутаций под названием MosaicHunter, которые предназначены для выявления соматических мутаций без использования контрольных тканей.
Метод отбора проб
Одноклеточный анализ полезен для выявления соматических мутаций, которые возникают позже в развитии. Однако ложноположительные результаты индуцируются дезаминированием во время лизиса клеток, смещением амплификации и ошибками во время WGA. Каждый метод WGA (MDA, MALBAC или DOP-PCR) связан с преимуществами и недостатками. Предполагается, что линейное усиление с помощью транспозонной вставки (LIANTI), недавно предложенного метода WGA, уменьшает смещение усиления. Ложные срабатывания, указывающие на C> T из-за спонтанного дезаминирования C> U во время одноклеточной подготовки, могут быть уменьшены с помощью урацил-ДНК-гликозилазы. Перенос ядер соматических клеток (SCNT) нейронных ядер в энуклеированные ооциты также был предложен в качестве метода WGA.
Добавить комментарий